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百家争鸣-rna扩增方案

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浏览:- 发布日期:2016-09-29 14:20:45【 】

rna扩增技术的出现和发展,解决了rna相关实验样本不足的问题,而且从1990年,brady首次描述了一种基于链式聚合酶反应(pcr)的cdna扩增方法之后,几乎同时eberwine等提出了基于体外转录的线性rna扩增方案,自此,各种rna扩增方法被发展出来。面对这么多rna的扩增方法,如何才能找到一款适合自己实验设计的rna扩增方案呢?

其实,迄今为止,rna扩增的方法虽然很多但不外乎三个策略:(1) pcr指数扩增;(2) 体外转录线性扩增;(3) phi29 聚合酶扩增。通过扩增,rna被放大了几百万倍,从皮克级别增加到微克级别,继而可以进行后续的文库构建以及,且后续操作与普通样品操作相同。

1. 基于pcr的cdna扩增

对极少量(单细胞也可)rna进行反转录,所用引物为poly(t)并加上锚定序列up1,没有被利用的引物要消化掉。poly(a)尾加到cdna第一链的3’末端,cdna第二链用加锚定引物序列(up2)的poly(t)合成。用up1和up2为引物对cdna进行均匀的pcr扩增,扩增产物片段化后,在末端加上p1和p2引物。最后,微滴pcr通过将文库与共价结合在1mm珠子表面的p1引物混合进行。

优点:通过延长反转录时间,获得过半的表达基因的全长cdna;通过延长pcr扩增的延伸时间,使cdna长度更长;基因片段化选择80-130bp,尽量保留了短cdna;采用热启动taq酶,减少背景扩增;采用5’-端带胺基的引物防止cdna双链的5’端与solid文库接头连接。

缺点:无poly(a)的rna不能被检测,长度大约3kb的rna的5’端不能被检测,由于cdna是双链,不能区分sense链还是antisense链。

2. smatrer扩增方法

smarter的方法最早用于cdna文库的构建,至今clontech的文库构建仍然采用此种方案。将smarter方法用于rna扩增的方法:cds 引物含有sfiib位点,启动反转录。一个模板转换寡核苷酸序列(ts-oligonucleotides),含有sfiia位点。

当反转录到达rna5’末端后,逆转录酶的末端转换活性会在cdna末端加非模板编码的核苷酸,通常是dctp,tso包含3个组成的rg,在3’端作为反转录合成的第二个模板。当反转录到达mrna的5’末端,tso3’的r(g)3和cdna序列中富含dc的序列依靠互补作用促进模板转换。反转录酶会转录这个寡核苷酸序列,从而使cdna带了sfiia的锚定序列。双链cdna的产生是通过pcr完成,引物为5’锚定序列和cds引物序列。

优点:能够得到全长cdna。用于分析可变剪切等

缺点:只分析带poly(a)的rna

3. 两轮体外转录扩增法

第一链cdna合成时所使用的引物为t7-oligo(dt),以便引入一个t7启动子,后续用superiii反转录酶催化反应生成cdna一链,第二链cdna合成过程中,cdna:rna杂交产物中的rna被rnase h消化成小片段,引导cdna第二链的合成。利用带t7转录启动子的双链dna,启动体外转录合成大量arna(t7 rna聚合酶)。使用第一轮合成的rna进行第二轮的第一链cdna合成,引物是随机引物,super ii反转录酶催化生成cdna。第二轮中的第二链cdna合成先用rnase h把dna:rna杂交产物中的rna消化,第二链cdna合成用t7-oligo(dt)引物合成cdna。再次使用体外转录法第二轮合成大量arna。

优点:利用总rna样品,可成百万倍线性扩增mrna,去除了模板依赖性。

缺点:只能分析带polya的mrna。扩增后的片段在300-3000bp范围内,平均长度在500bp左右,大部分不是全长cdna,具有3′端偏好,对于分析rna的可变剪切并不是一个好的选择。

4. ovation扩增方法

ovation采用了spia技术,该技术在cdna一链合成时,采用了一种独特的一链合成引物,该引物为dna/rna的嵌合引物混合物,它的dna部分能够和poly(a)的5′末端部分或整个转录本的任意部分进行杂交,反转录时每条引物的3′dna末端都能够独立反转录出一链cdna。生成的cdna/mrna杂交分子在cdna链的5′末端包含一个特殊的rna序列。

将cdna/mrna复合体的mrna分子进行片段化,生成合成引发位点使dna聚合酶能够催化cdna二链的合成,且二链包含与5′特异序列互补的一链中的嵌合引物。spia采用等温链置换扩增反应,使用dna/rna嵌合的spia引物、dna聚合酶和rnase h进行rna扩增反应。

优点:可以分析除rrna之外所有rna,可以进行微量样本的lncrna的分析,并且可以分析rna降解的样本。

缺点:rna起始量越高,在数据中的rrna reads会相应增加。

当然还有其它很多方法,例如malbac法,phi29多重链置换法等不再一一列举。

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