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干货分享 | 如何在肺肿瘤微环境中构建基质细胞的表型模型?

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浏览:- 发布日期:2018-12-11 10:36:19【 】

前 言

癌旁的基质细胞,如巨噬细胞,t细胞和纤维母细胞,组成了肿瘤的微环境。肿瘤微环境是一个极其复杂的细胞生态系统,但是这些基质细胞的异质性,以及基质和肿瘤细胞之间的相互影响都还没有明确的研究成果。

人们意识到某些基质癌旁细胞也可以作为癌症新的治疗方案的靶点,非小细胞肺癌(nsclc)患者就可以从此方法中获益。

实验方法

1、单细胞悬液制备

五名未治疗的的非转移性非小细胞肺癌(nsclc)患者,每名患者都有不同程度的的慢性阻塞性肺疾病(copd),手术切除选取每个患者的三个肿瘤组织,以及其中4名患者的非恶性组织样本作为研究样本。切除后样本用pbs清洗,将每个肿瘤组织分成3份:肿瘤中心组织、肿瘤边缘及二者的连接处的组织。

将样本在冰上剪成小于1mm的碎块,然后用10ml消化液进行消化处理(含0.2%的胶原酶i/ii、dnasei和25 units中性蛋白酶的dmem),37℃,15min。pbs重悬后过40um筛网,离心,弃上清;红细胞裂解,离心(水平转子)弃上清,用0.4%bsa的pbs重悬,过40-μ m cell strainers,测活性。

2、单细胞测序

用10x genomics的chromium single cell 3’ library kit构建文库,每个文库回收4,000 cells,用illumina hiseq4000仪测序。

3、生物信息学分析


结果分析

1、肺肿瘤和非恶性组织的scrna-seq结果及细胞类型

本文对5位患者,19个样本(15+4)进行研究(fig.1a),共52,698个细胞进行单细胞转录组分析,有39323 cells (75%)来源于肺肿瘤组织,13375个来源于非恶性的肺组织细胞(fig.1a,b)。通过对2200个差异表达的基因进行pca分析,将细胞分成了8种不同的亚群,包括癌细胞、免疫细胞(骨髓细胞、t细胞和b细胞)、纤维母细胞、内皮细胞、肺泡细胞和上皮细胞。这些细胞的转录活性有显著差异,每个t cell有1,678 transcripts (764 genes),每个cancer cell有6,746 transcripts (1,828genes) (fig.1c,d)。此外,作者还对另一名患者的肿瘤和非恶性肺部样本进行bulk rna-seq,发现与单细胞rna-seq数据结果有很好的相关性。


fig. 1 | overview of the 52,698 single cells from lung tumors and distal non-malignant lung samples

a.取样患者的基本信息; b.52,698个细胞的t-sne图,包括细胞来源(肿瘤/非肿瘤)、病人分布、细胞类型以及转录本的表达丰度(umis); c.不同基质细胞亚群marker gene表达图; d. 52种基质细胞亚型和12种癌细胞亚群的细胞与转录本在不同细胞类群、组织类型、病人等的分布。

通过对不同类型细胞的基因表达做进一步的分析,发现了一个复杂的细胞生态系统,由52种基质细胞亚型和12种癌细胞亚群组成。虽然癌细胞亚群有高度的病人特异性,但却在几个患者中均发现了相同的基质细胞亚群,即基质细胞亚型主要由3位患者的细胞构成(患者3/4/5)(fig.1d)。通过比较分析肿瘤和其对应的非恶性肺组织结果,研究人员发现,许多基质细胞亚群富含肿瘤衍生细胞或者肺组织衍生细胞。为了验证这一发现,他们又对3名nsclc患者进行了约40250个细胞的单细胞rna-seq,并发现了之前已经发现的52种中的45种基质细胞亚群。(s fig. 5)

因此,本文将进一步探究主要基质细胞亚型的变化。

2、肿瘤内皮细胞下调免疫归巢/吸引通路(attraction pathways)

对1592个内皮细胞(ec)进行分析,得到了6 clusters,并发现ec在肿瘤中呈现低丰度(fig.2a)。对每个cluster的marker gene进行鉴定,在肿瘤和非恶性样本中发现了85个淋巴内皮细胞(cluster 6; marker genes pdpn and prox1);5组血液内皮细胞:2组主要由肿瘤衍生(clusters 3 and 4; igfbp3+and spry1+),另2组是非恶性肺组织衍生(clusters 1 and 5; mt2a+ and ednrb+)(fig. 2a,b; sfig. 6),剩下的1组无marker gene(clusters 2)。当评估108个非恶性肺的bulk rna-seq中的marker gene的表达时,在tcga中列出的501个lusc或513个luad肿瘤,正常和肿瘤内皮细胞的marker gene分别在非恶性肺和肺肿瘤中富集(fig. 2c)。肿瘤和正常内皮细胞比较发现myc(原癌细胞)在肿瘤ec中靶向富集(fig. 2d)。

对ec转录本表达丰度进行研究发现肿瘤ec有较高的rna含量是由于转录速率增加(fig. 2e,s fig.9)。进一步研究揭示了基因下调与免疫激活和免疫细胞归巢相关,重要的是,内皮细胞是循环免疫细胞与肿瘤之间的主要接口,在传递信号和从组织中呈递抗原表位起到重要作用。下调的基因类包括抗原呈递(主要组织相容性复合体ⅰ和ii),趋化性(ccl2, ccl18, il6) 和免疫细胞归巢(icam1) (fig. 2f)。以上结果表明肿瘤ec被重塑以下调其抗原呈递和免疫细胞归巢活性,从而有助于肿瘤的免疫耐受。 


fig. 2 | endothelial cell clusters

a.1592个内皮细胞的6个亚群以及在肺癌与正常样本的t-sne图; b.marker基因在四类亚群中的表达t-sne图;c. marker gene在正常和肿瘤内皮细胞在tcga表达的平均值;d.肿瘤和正常组织内皮细胞的通路活化情况,利用gsva分析;e.内皮细胞转录本表达丰度的t-sne图;f.1,5,3,4 四个细胞亚群中血管生成和免疫活化有关基因表达的小提琴图;g.聚类热图,肿瘤与正常细胞中通过scenic分析得到的10个最显著转录因子表达;h.三个转录因子表达及靶基因表达的t-sne图

 

3、肺肿瘤中有五种不同类型的纤维母细胞

1465个纤维母细胞分成7个cluster,cluster 1、2、4、5、7在肿瘤中富集,cluster 6在正常组织中富集。与其他肿瘤衍生纤维原细胞不同,cluster 6的高弹性蛋白表达水平较高,而一些胶原蛋白(i, iii, v 和viii)表达水平较低(fig.3d)。由于不同的胶原蛋白在细胞外基质中有不同作用,表明每种纤维原细胞都有功能特异性。


 

4、b细胞和巨噬细胞在肿瘤中分布

5603个b细胞分成9个cluster,6个在肿瘤中富集,3个在正常组织中富集(cluster 4、8、9)。pathway分析未找到非恶性肺和肿瘤衍生的plasma b细胞或malt b细胞之间的差异。但作者鉴定出了肿瘤相关的follicular b细胞的氧化磷酸化、细胞增殖和生物量均降低(fig4d);此外,肿瘤相关的follicular b细胞的转录本比正常的低37.9%,这些数据表明follicular b在肿瘤中已被耗尽。


fig. 4 | b-cell (a-d) and myeloid-like cell clusters in lungs and lung tumors

9756个巨噬细胞分成12个cluster。tsne图揭示肿瘤和非恶性肺组织巨噬细胞之间的二分性。

 

5、肿瘤t细胞转录组揭示了新的免疫治疗靶点



6、基质细胞在肿瘤中的分布及其与病人存活的关系

缺氧与肿瘤行为的许多重要方面相关,包括血管生成、转移、代谢调控基因和免疫逃逸。因此我们将每个肿瘤分为3部分:肿瘤核心部位、中间部位和边缘,探究癌细胞的分布情况。结果发现,在更缺氧的肿瘤核心的癌细胞比中间和边缘更多;而大部分基质细胞在含氧量正常的肿瘤边缘富集(fig.6a,b)。

42个细胞亚型中,只有9个细胞亚型的marker gene在luad和lusc之间的表达有显著差异(>2 fold,fig.6c)。其中两种亚型的表达差异可能反映了肺肿瘤的细胞起源,其中luad来源于at2细胞,lusc来自基底细胞。cd8 t-cell cluster 8和纤维原细胞 cluster 5可能反映了组织病理学的差异。

此外,本文评估了1572名病人(1027 luad和545 lusc)的细胞亚型与病人存活率的关系。通过对患者年龄、性别和肿瘤时期等多变量校正分析发现,基质marker gene表达增加时lusc病人的存活率下降,而非luad病人(fig.6d)。如flat at1 cells, respiratory epithelial cells and cross-presenting dendritic cells高表达时lusc病人存活率降低,而cd8+ t-cells cluster 8正好相反。(fig.6e)


fig. 6 | distribution of stromal cells in tumor samples and their role as markers of patient survival

 

结论

本文从单细胞水平建立了人肺癌和正常肺组织的基质细胞索引信息。该研究为肺癌生物学提供了新的见解,并可能有易于肺癌的诊断和治疗。例如通过用亚型特异性的标记基因来为诊断和治疗提供一种新机遇,某些基质癌旁细胞也可以作为新的治疗方案的靶点。

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