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功能基因筛选干货系列?mbs(一)

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浏览:- 发布日期:2016-11-29 08:57:29【 】

mbs相关技术介绍

abstract

我们知道,正向遗传学筛查是分子遗传学家最初可以使用的一种鉴定产生某种特异表型的变异的方法。这个方法之所以成功,是因为其涉及的分子基础非常简单,最典型的就是单基因引起的突变。传统遗传学方法定位突变历来是一个复杂的过程,步骤繁多。但现在ngs让我们能够在复杂遗传背景下以单核苷酸分辨率快速鉴定突变。mbs这种不依赖于遗传杂交、参考基因组以及任何连锁信息的方法极大地拓展了正向遗传学筛选的使用范围。

正向遗传学筛查(forward genetics screening);ngs(next-generation sequencing,下一代技术);mbs(mapping by sequencing)

forward genetic screening

正向遗传学筛查是一个强大的技术,几十年来一直用于基于表型的基因和突变鉴定。正向遗传学筛选在几乎所有的生物系统中都遵循相同的基本原理。遗传背景清晰的生物体使用dna损伤剂如辐射或化学诱变剂诱使其产生随机突变,然后筛选出具有感兴趣的突变表型的群体。要找到表型变异相关的遗传变异通常是一个繁琐的过程,先要遗传作图来定位染色体区域(即映射区间),随后在该区域对候选突变进行有针对地检索。对突变基因是否确实影响了目标表型进行验证,通常涉及突变基因的连锁位点和其野生型对应位点的验证,并且(理想地)也通过功能来验证*。基因鉴定通常会进一步引出对突变基因作用的研究。尽管正向遗传学筛查策略的使用很广泛,其目前仍多用于各种遗传学特性已经比较清晰、方便进行简单诱变的模式生物。模式生物拥有较多成熟、通用的基因组操作工具以测试和表征目的基因及突变基因。

*例如对突变基因的野生型等位基因进行内源性干扰并观察表型

genetic mapping & bulk segregant analssis

在过去的几年中,由于各种技术和方法的发展,正向遗传学筛选中的遗传图谱构建这一步骤有了很大的进展。举一个典型的例子:已分离一个目标表型的突变体,且已经用一个优秀的群体构建方案构建了一个重组作图群体,同时包含两种表型的突变体和野生型;具有突变表型的重组个体是位置未知的相关突变基因的携带者。由于突变和其附近的遗传标记频繁重组,这些连锁的遗传标记中包含的等位基因将与突变共分离,而不连锁的等位基因在野生型和突变型之间将会随机分布。因此,对重组群体中突变表型的筛选将导致野生型和突变体中等位基因分布的明显不同;基因分型分析可以检测这种衍生自突变背景的等位基因的差异,并指导后续突变区域定位的分析。所以,分析重组群体(而不是单独个体重组基因组)的等位基因频率可用于表型关联基因组区域定位。这通常被称为混合分组分析或选择性dna混池,使得等位基因频率在dna池(dna pool)被富集,大大简化了基因分型的工作。

混合分组分析(bulk segregantanalysis, bsa)

resolution

基因分型时遗传图谱的分辨率主要取决于多态性标记的密度。随着第一个参考基因组以及大型卫星标记的释出,全基因组高通量基因分型方法(例如杂交芯片)成为可能。基因分型的应用因其大型作图群体的成本而受限。但是结合bsa,同时定位单基因位点和复杂的多基因位点便成为可能。然而,突变体分析通常只能定位包含突变的染色体区域,这是同遗传标记分析的区别。因此,还需要靠来找到这个区域实际的突变位点。

mapping by sequencing

对上述“两步法”的需求随着下一代技术的发展而改变。ngs不仅能够进行遗传标记的鉴定、量化等位基因的频率,而且可以揭示实际的核苷酸序列,因此这种被称为mbs的技术能同时定位和鉴定突变基因。

application

qtl-seq

bsr

在过去的几年中,越来越多mbs技术的应用拓展了ngs技术在正向遗传学筛查方面的潜力。在本系列中,小编将向大家综述一下这些技术和应用,介绍各物种中突变基因的定位和鉴定。本系列聚焦于混池样品中的突变鉴定或突变个体;概括了各种群体构建方案,各种格式的ngs数据的优缺点(例如dna、rna或富集),并介绍了分析数据所用的计算策略(barcoding strategies)。ngs也可以同条形码策略结合使来自混池样品的测序reads能够匹配到产生它们的个体上,但是这些方法的细节将在其他地方描述。

下期小编将为大家带来各种来源的突变和各种遗传群体的介绍,敬请期待!

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