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功能基因筛选干货系列?mbs(二)

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浏览:- 发布日期:2016-11-30 15:42:07【 】

在上一期[mbs(一)]中,小编为大家介绍了mbs相关的一些技术,大家已经了解到mbs主要是做突变候选基因研究的。那么今天我们就来了解一下突变的产生以及mbs技术中对突变的富集——遗传群体的构建。

mutantgeneration

用于不同模式生物的微生物已发展出各自独特的诱变方式。广泛使用的全局诱变有化学诱变和辐射诱变。高变异剂量可在单筛时产生更多变异;然而,这也增加了单个基因组中的突变,与目标突变连锁距离过近的突变会使突变基因验证复杂化。

大规模基因突变引起突变的密度,例如大片段缺失或倒位,通常比单碱基改变导致的基因突变的频率小一些。然而,大规模基因组重排可能扰乱整个连锁基因;这样,即便鉴定出相关突变,仍可能无法确定哪个基因造成了突变表型。

诱变之后,根据感兴趣的表型进行突变体隔离的筛选策略由其物种、育种体系、表型和主效突变决定。mbs并不仅限于某些特殊物种的特殊突变,即使mbs中的某些方法需要突变基因组上相关位点是纯合子或拥有充足的突变位点。

thevariety of crossing schemes

作图群体的实验设计需要考虑很多因素,包括育种体系、构建时间、遗传背景、突变的外显率和优势度,同时也需要考虑期望型和突变率。下面,小编着重讲述mbs中最常用的群体构建方案。

classical mapping populations

在拟南芥[1]中第一次报道了用wgs对一个混合的作图群体同时突变的定位和鉴定。一个ems诱变的生长缺陷突变型被用来构建一个f2作图群体:通过将经一轮自交的分离后代与突变体杂交来进行。共500株突变体进行混池测序(测序深度22x)。得到的短reads分别与参考序列比对,超过80000个标记位点被用来估计突变中心所在的区域,突变等位基因通过混池进行了富集。距离这个估计的突变中心不到5kb的地方是一个snp。第二个最近的突变被定位到约250kb远的地方,是无可争议的候选突变,并且随后的鉴定也确认其与生长缓慢的表型有关。

这个非常直观的方法很快被用于其他隐性突变研究,包括有参、无参物种,例如saccharomyces cerevisiae、caenorhabditis elegans、neurospora crassa、mice和zebrafish。相比之下,显性或共显性突变通常无法依靠突变体混池来“修正”注。尽管如此,显性突变在连锁和不连锁区域的选择也会产生不同的分离比,尽管可能只有微小的等位基因频率差异。mbs方法富集突变等位基因频率(mutant allele frequencies, mafs)可以被用来寻找这种区域。相关位点野生型等位基因的存在会对准确估计微小的等位基因频率差异造成影响。因此在某些情况中,定位显性基因比定位隐性基因更好。

突变体与分离株系杂交为突变体重组引入了清晰的遗传背景,可以改变或干扰突变表型。举个例子,在56个f2代a. thaliana突变体重组系中,最近的研究[2]发现,作图间距的大小比预期要大了很多,这说明作图群体被错误的植株污染(即,那些按表型进行分类的突变体实际上在突变相关位点上潜藏着野生型的等位基因)。随后的mbs分析结果找到了42个相关位点,只有38个是突变等位基因。

isogenic mapping populations

使用纯合突变体与非诱变的亲本杂交产生的等基因回交群体进行mbs分析,能够克服构建群体使野生型与突变型显现差异时产生的混乱。使用这种群体做mbs与经典作图群体基本相同,除了唯一分离出的遗传多态性是由突变引起的,并且该突变要被用作标记。因为这种标记在各个突变基因组上是特异的,它们需要被鉴定,通过比对基因组或在不同dna池中查找标记差异。因此,等基因群体的遗传作图只在ngs技术出现后才成为可能,并且不能用snp分型芯片之类的传统基因分型平台来进行,因为这些平台通常使用自然产生的多态性作为标记。到目前为止,使用等基因群体的mbs研究仅在菌类和植物[3-7]中使用;然而,它也适用于其他利用经典群体进行的研究。

等基因mbs一个有趣的应用是定位致死或传播性较差的突变,这种情况里不能做纯合突变体。如果杂合子突变携带者展现出一个不同于野生型的表型,那么它们就可以被选择并且与野生型个体进行两次回交。在回交群体中,杂合突变个体的选择将保持突变体中的相关突变位点:野生型等位基因的比例为1:1;反之,不连锁的突变将被回交过程稀释,只在突变体中出现:野生型等位基因的比例为1:3。因此,与显性或半显性突变的定位类似,突变体并未被“修正”,但是能够用基于maf估算的mbs鉴定。

因为突变体回交通常移除了背景突变,回交群体也许已经能够用于某些突变的遗传筛选且不需要重新分离。尽管许多已经存在的群体都是基于多重回交构建的,回交世代数只对mbs有很小的影响。

另一个潜在的构建重组作图群体的捷径是利用杂合突变体携带者(已经出现在群体中或者说是家系中的纯合突变体的姊妹植株当中),它们本来就已经被鉴定过了。自交(或杂交)这种姊妹植株可以揭示它们是否真的是杂合突变携带者并且产生了分离群体,这样就绕过了两个通常需要构建回交群体的世代。

回交群体的一个基本特点是,对第二位点突变注的鉴定来说,其构建非常简单。与传统的作图群体相比,使用包含已知第一位点突变的突变系和野生系能够促成等基因回交群体,第一位点突变在重组时的出现并不需要是已分型的,也不需要引入一个分离背景。值得注意的是,由于标记密度的限制,基于回交群体的mbs受到序列覆盖度的强烈影响,它会干扰细微等位基因频率差异的识别。

homozygosity mapping

为了鉴定可能包含突变的相关区域,已经对受影响的个体进行了基因组分析:近亲结婚中人类近交系疾病等位基因的定位已经引入纯合体定位。在这些个体中,突变经两次分离进入共同祖先的二倍体基因组——一次通过母系一次通过父系。毗邻突变的区域将成为纯合子并且可以用作基因组内标记物来鉴定相关区域。

mbs(估计本地mafs)相比,纯合子定位是通过筛选基因组低杂合度的扩展区域来进行。如果有同系的多个突变,那么纯合子定位可以用bsa实现。为了进一步增加分辨率以及去除与相关位点不连锁的纯合子区域,可以加测不同系多重变异的后代或无突变姊妹体池。对需要保持杂合位点的突变体来说,用纯合子定位的方法来定位相关突变是不可能的。然而,经过一次杂交的杂合子突变体携带者材料应已获得,它可以用于纯合子定位,如果近亲繁殖的程度允许这样的杂交的话。

mbs纯合子定位有两个主要的特点:首先,它使mbs能够用于无法构建作图群体的多世代物种;其次,它使mbs无需任何亲本等位基因或清晰详细的杂交背景信息。尽管精确度可能不及基于maf估计的定位,纯合子定位仍然是一种基于可控杂交的、极具吸引力的替代方法,尤其是当材料合适的时候。

directsequencing of individual mutant genomes

对突变系基因组的完整描述是替代遗传定位的有效方法。实验室培育的枯草杆菌生长抑制突变体的测序是第一个用ngs进行wgs的报道。通过测试总共10个自然突变体,该研究发现,稳定的抑制表型需包含两个基因的缺失,这样的一个三基因相互作用很难用传统的定位方法鉴定。

尽管这个例子显示完全了解突变体的基因组多么有用,由于大量突变的存在,立即对诱变基因组进行感兴趣的突变的鉴定仍然是非常复杂的。尤其是,化学诱变可以引起数千突变,因此建议用不同的策略减少相关突变的量。

代替于原生突变系的直接,对一个重组的突变基因组(例如,通过回交产生野生型来去除背景突变)测序,减少突变量,这样突变体基因组的一部分将被替换为野生型dna。类似地,基于之前已鉴定的定位区间,能够进一步优化突变体基因组中鉴定的突变。另一种在wgs中优化突变的方式是对多个突变等位基因进行分析,并在同一个基因里共享突变信息。尽管在单个基因组上的突变可能会影响多至数百个基因,在所有等位突变中通常只有一个基因或者一些基因的很小一部分功能发生重大改变。

到目前为止,所有通过直接对突变体成功定位突变的报道都利用基因编码潜力的强力影响优先化了突变,这样做有丢失相关调控突变的风险。虽然如此,对突变基因组进行直接测序是一个明智的策略,如果重组的突变个体中的突变相关位点的定位信息和多个突变等位基因的定位信息可用的话。此外,如果使用了一个低突变率的诱变剂(举个例子,快中子辐射或者在自发突变的情况下)、突变体表型不明显或外显率很低,或者如果对突变个体基因组的完整测序特别感兴趣,对突变个体进行直接是可行的。

注:

修正(fixed):使一个突变的等位基因以纯合子状态出现在该群体的每个个体中。

第二位点突变(second-site mutations):在为了分离突变而被给予的一个通路或过程损伤了基因的生物体中引入突变,这是为了减弱或增强第一次突变的影响。

下期小编将为大家带来突变定位和鉴定方法的介绍,敬请期待!

reference:

[1] k. schneeberger, et al. shoremap: simultaneous mappingand mutation identification by deep sequencing. nat methods. 6, 8: 550-551 (2009).

[2] m. v. greenberg, et al. identification of genesrequired for de novo dna methylation in arabidopsis. epigenetics. 6, 3: 344-354 (2011).

[3] h. lindner, et al. snp-ratio mapping (srm):identifying lethal alleles and mutations in complex genetic backgrounds bynext-generation sequencing. genetics.191, 4: 1381-1386 (2012).

[4] a. abe, et al. genome sequencing reveals agronomically important loci inrice using mutmap. nat biotech. 30,2: 174-178 (2012).

[5] m. nowrousian, et al. whole-genome sequencing ofsordaria macrospora mutants identifies developmental genes. g3 (bethesda). 2, 2: 261-270 (2012).

[6] k. j. nordstrom, et al. mutation identification bydirect comparison of whole-genome sequencing data from mutant and wild-typeindividuals using k-mers. nat biotechnol.31, 4: 325-330 (2013).

[7] r. s. allen, et al. facile mutant identificationvia a single parental backcross method and application of whole genomesequencing based mapping pipelines. frontplant sci. 4, 362: 362 (2013).

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