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关于三代测序的那些小事

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浏览:- 发布日期:2017-05-08 15:26:48【 】

随着技术的不断发展与创新,近年来ngs技术得到了前所未有的应用,无论在基础理论研究还是医学研究中ngs都能很好的解决我们所遇到的难题。但是ngs技术在实际应用中也还是存在着一些缺陷,如读长较短,无法跨越基因上的串联重复序列。这时tgs就应运而生,tgs的优势就在于读长较长,一般能达到10kb左右。

接下来我们就来简单的讲讲tgs的基本原理。目前市面上主流的三代测序技术主要是pacbio公司的smrt和oxford nanopore technologies纳米孔单分子技术。

pacbio公司的smrt:

基本原理是:dna聚合酶和模板结合,4色荧光标记 4 种碱基(即是dntp),在碱基配对阶段,不同碱基的加入,会发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。同时这个 dna 聚合酶是实现超长读长的关键之一,读长主要跟酶的活性保持有关,它主要受激光对其造成的损伤所影响。

pacbio smrt技术的一个关键是怎样将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来。他们利用的是zmw(零模波导孔)原理:如同微波炉壁上可看到的很多密集小孔。小孔直径有考究,如果直径大于微波波长,能量就会在衍射效应的作用下穿透面板而泄露出来,从而与周围小孔相互干扰。如果孔径小于波长,能量不会辐射到周围,而是保持直线状态(光衍射的原理),从而可起保护作用。同理,在一个反应管(smrtcell:单分子实时反应孔)中有许多这样的圆形纳米小孔,即 zmw(零模波导孔),外径 100多纳米,比检测激光波长小(数百纳米),激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区,能量被限制在一个小范围里,正好足够覆盖需要检测的部分,使得信号仅来自这个小反应区域,孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中,从而实现将背景降到最低。

oxford nanopore technologies纳米孔单分子:

它是基于电信号而不是光信号的技术。该技术的关键之一是,他们设计了一种特殊的纳米孔,孔内共价结合有分子接头。当dna碱基通过纳米孔时,它们使电荷发生变化,从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度(每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的),灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。

这就是tgs的原理介绍,那么大家接下来又会关心它在实际中有什么应用?今天我们就来讲讲它在病毒基因组中的应用。众所周知,病毒的基因时常发生突变导致我们对于那些高突变率的病毒很难找到有效的治疗药物及治疗方法。由于病毒突变频率较高,这就导致一位患者体内的病毒也存在着十分巨大的差距。因此一代技术就无法满足我们需求,目前市面上大多的方案都是通过ngs来进行病毒基因组的研究,但是ngs的主要缺陷就是读长短,所以有些对读长要求较高的的特殊分析如检测联合变异时灵敏度较低,这时就需要tgs来弥补其不足。同时由于ngs在建库过程中需要用到pcr扩增,因此在这一步有可能会有概率引入突变,而tgs则无需通过pcr这也保证了测序结果的准确性。目前也有研究表明,tgs也能用于病毒的耐药位点的检测。

而我们相信tgs在病毒研究中应用远不止这些,相信随着tgs技术的日益成熟,它的相关应用也将会遍及各个研究领域。

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