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环状rna的rt-pcr引物设计方法

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浏览:- 发布日期:2016-09-30 14:32:22【 】

随着对的研究越来越热,进行的研究也越来越多,通常在得到circrna的结果之后,都会进行的rt-pcr检测来验证数据,但是的引物设计及pcr后产生的结果是什么样子的?我们以zkscan1基因的一个已知为例进行说明。

我们给出的circrna预测结果是这样的:

通过ncbi对该序列进行比对可以确定它是zkscan1的rna剪切成环位点之间的线性序列,其方向与正常线性rna一致,序列的两段是剪切位点:

正常pcr引物设计是这样的:

f为正向引物,它以b链为模板,合成时的碱基序列是a的原始序列;r是反向引物,它以a链为模板,合成时的碱基序列是b的原始序列,这样设计出来的引物是扩增f和r之间的序列,这个原理相信只要做过pcr的人都明白。

扩增出来的产物之后在ncbi中做序列比对的结果是这样的:

序列比对图是这样子:

query和subjct的数字是单向的。

设计的pcr引物时,则需要将原来的引物进行反向互补,变成这个样子:

合成的引物是f’和r’,其中f’是r引物的反向互补序列,r’是f的反向互补序列,当然命名可根据个人喜好调整,只要序列别搞错就可以,当然位置也可以变化。

f’和r’结合扩增出来的片段进行后,将序列在ncbi中进行序列比对时结果是这样的:

看到黑色椭圆所标记的巨大区别么?这个代表不连续的mrna分子,反映在序列上是这个样子的:

看出来了吧?query序列被分成两段:71-298和1-72,而且71-298对应的是原mrna序列的113bp-341bp和1bp-72bp对应的是原mrna的707bp-782bp,从这个结果可以看出,这个rna成环是113位置和782位置的碱基拼接到一起了。过程是这样子滴:

的引物设计及成环检测就这样进行,当然引物设计之后的实际扩增效果还需要进行实验确定,如果是想进行qpcr实验的话,扩增长度需要按照qpcr的实验要求设定。

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