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蛋白与蛋白互作的研究方法中,酵母双杂交体系是很受欢迎的。但是在实验完成后怎样进行数据整理,使文章结构更完整。今天小编结合一篇发表于plant physiology上的文章(文末有链接),带大家梳理一下。


首先是,当实验做完数据统计发现内容不够怎么办?在蛋白选择上,有木有做到以下几点。

如果你只有一个诱饵蛋白,做完筛选后,是否有继续将其结构域进行细分研究?

是否有向其互作基因的家族进行延伸研究?

是否有对其近缘物种或模式生物的相同基因进行比较研究?

例如在该文章中,作者对水稻基因ospho2 与ostrxh1、 ostrxh4是否有互作进行研究时,在构建载体时先使用了全长序列作为诱饵进行文库筛选,结果这两个基因被筛选到,显示互作。同时作者又克隆了trxh家族的其他基因,与ospho2进行一对一验证。得到了ospho2 可以结合trxh1和 os trxh4,但是不能结合 os trxh3/h5/h6/h7/h8/h10的结果。

从整个蛋白,进一步细化到功能域。作者将ospho2分成了n端(1-633 aa)和c端(589-876 aa)两部分,继续进行互作研究,确定其作用的具体位置(文中后半部分甚至细化到了蛋白的单个motif--wcgpc,在此不进行赘述)。

除了纵向研究水稻中pho2与trxh家族的互作关系外,作者还横向比较了拟南芥中at pho2与 at trxh2/h7/h8的互作关系。


第二,酵母双杂交体系是存在假阳性概率的。所以完整有说服力的研究是需要结合多种方法互相佐证的。比如bifc,co-ip,pull-down等蛋白互作方法。在该文中作者通过bifc证明了ospho2-ostrxhs在水稻原生质体中存在互作。通过pull-down证明了ospho2-ostrxhs的体外互作。另外,在酵母双杂交体系中,有可能因为表达载体上的核定位信号或者细胞结构不同等原因,使原物种细胞中定位于不同时空的蛋白,在酵母细胞中表达后被拉到同一细胞核或相近位置中,由于空间上接近而产生假阳性互作。基于此,通过蛋白亚细胞定位研究,可以从空间上佐证蛋白互作的真实性。在该文章中,作者通过亚细胞定位发现,ospho2主要定位于er,ostrxh1 主要定位于细胞质、细胞核;ostrxh4主要定位与细胞质和er。另外通过引用相关文献报道的ostrxh1 也会分泌到胞外,间接证明其来源于粗面er。从空间上证明了蛋白互作的可能性。

最后,通过对所研究基因的野生型、突变型和互补型株系的基因表达量、生长形态、生理生化指标进行检测,使研究更接近于生产应用,也是极好的。该文章中检测了wild type nipponbare (nip), pho2 mutant,和complemented lines的叶片含磷量,对比分析了其生长形态差异,宏观上研究了ospho2的作用。最后的最后,在研究总结部分,一定不要忘记绘制信号通路图,意义你懂得。



·文献引用

ying y , yue w , wang s , et al. two h-type thioredoxins interact with the e2 ubiquitin conjugase pho2 to fine-tune phosphate homeostasis in rice[j]. plant physiology, 2017, 173(1):812.

友情提醒:做酵母双杂交,选欧易生物~

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本文系欧易生物原创

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