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膜体系 核体系酵母双杂筛库之不同

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浏览:- 发布日期:2017-02-20 14:48:43【 】

今天小编来帮大家理理核体系、膜体系酵母双杂筛库实验过程中的不同点。

首先,筛库所用菌株不同,在通过共转方式筛库时,核体系使用y2hgold酵母菌,膜体系使用nmy51菌株。核体系除了可以选择共转筛库,还可以通过mating的方法进行。mating自然要用到两种性别的菌株,含有ad文库质粒的y187和含有bd质粒的y2hgold。下表是三种菌株的基本信息。

菌株

交配类型

报告基因

转化标记

y2hgold

mata

abar,his3,

ade2,   mel1

trp1,   leu2

y187

matα

mel1,lacz

trp1,   leu2

nmy51

mata

his3,   ade2,

lacz

trp1,   leu2

第二,两者在整个实验的流程上有所差异。最重要的一点是,核体系酵母双杂中如果bd基因本身为转录因子时,可能存在自激活现象,因此在诱饵载体构建完成后首先要做的则是诱饵基因的自激活检测。而膜体系酵母双杂,理论上由于诱饵蛋白被“挂”在细胞质膜上,在没有互作蛋白相互靠近时,泛素的两部分彼此分离,转录因子不会被切割,便不会导致报告基因表达。而对于膜体系酵母双杂,因为诱饵蛋白在细胞膜上的跨膜方式不同,构建bd载体时选用的质粒不同。基于此,在bd载体构建完成后,首先要做的是功能验证,亦即所构建的bd质粒是否适用于该系统。下面是两种体系的筛库主要实验流程。

核体系筛库实验流程

膜体系筛库实验流程

另外,在阳性克隆的筛选方法上两者亦不同。核体系,因为报告基因中有mel1,在有蛋白互作时,α-半乳糖苷酶被表达,即在含x-α-gal的选择培养基上阳性菌落呈蓝色。膜体系中,主要是通过报告基因ade2的表达程度来筛选阳性克隆。无相互作用蛋白时,腺嘌呤合成被阻,中间产物积累,细胞变红,克隆表现出从开始生长至时间延长由浅粉变为暗红色。有蛋白相互作用时,克隆颜色由于作用强度不同,ade表达量不同,克隆呈现粉白(弱相互作用)至白色(强相互作用)。

今天小编先介绍到这儿,下回接着讲筛库实验细节中两者的异同~~

酵母双杂欧易生物~~~~


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