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p16的dna异常甲基化抑制基因转录,促进癌细胞转移

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浏览:- 发布日期:2016-09-27 09:55:13【 】

p16的dna甲基化对肿瘤转移的驱动作用

研究背景

前人研究报道,p16(又名cdkn62a或 ink4a)的dna甲基化在肿瘤发育过程中具有重要作用,并且该基因的遗传失活可以驱动肿瘤的生长和转移。但p16的dna甲基化是否是肿瘤转移的驱动器仍未可知。在本研究中,利用p16特异的甲基转移酶(p16-dnmt)使p16基因失活,研究对肿瘤细胞的增值、迁移、侵袭的影响,从而确定p16的dna甲基化对肿瘤转移的驱动器作用。

研究流程

样本取材

p16特异的甲基转移酶(p16-dnmt)载体转染各种细胞并进行相应技术分析。

研究技术

  • western blot

  • chip-seq或chip-pcr

  • illmina methylation 450k array

研究过程

1.p16 的dna甲基化直接抑制p16基因转录

为了确认p16的dna甲基化的对该基因表达的影响,作者构建了p16特异的甲基转移酶载体(p16-dnmt),并转化细胞,western blot检测发现p16明显减少。为了排除位阻效应对p16表达的影响,作者构建p16的dna甲基转移酶失活约80%的突变体(r822h),针对p16启动子区结合效率(chip-pcr技术)、p16的dna甲基化状态和p16基因表达情况进行分析,发现p16的基因表达降低是由于甲基转移酶作用引起,而非位阻效应影响。

图:western blot分析p16-dnmtp16的影响

图:p16-dnmt和r882h突变体中对p16启动子区结合效率, p16的dna甲基化状态及表达水平检测

为了验证甲基化是发生在p16启动子区的cpg岛上,作者构建了带有tet-on开关的ptripz慢病毒载体,同时利用 doxycycline处理,结果发现了p16的启动子区cpg岛高度甲基化和p16表达量极度降低。

图:p16-dnmt的ptripz‘tet-on’载体转染细胞后分析cpg甲基化情况和p16表达水平变化

为了进一步论证上述结果,课题组与上海欧易生物合作利用illumina methylation 450k array和chip-seq进行了检验,并结合生物信息学分析,获得了同样的结果。

图:infinium methylation 450k array和chip-seq针对p16甲基化状态分析

2. p16的dna特异甲基化促进癌细胞迁移和侵袭

p16-dnmt 的ptripz载体转染细胞后分析细胞的迁移能力和侵染能力,发现p16-dnmt 导致p16基因失活,进而增增强细胞的迁移和侵染能力。之后将转染后的细胞注入免疫缺陷的小鼠中,发现肺部重量增加,肿瘤区域扩大。

图:dna甲基化异常引起的p16基因失活对癌细胞迁移能力和侵染能力的影响

图:dna甲基化引起的p16基因失活对小鼠肺部重量和肿瘤区域大小的影响

为了确定以上结果,作者进行挽救实验,即在p16-dnmt的ptripz载体转染的细胞中进行p16基因的超量表达,结果发现p16基因的超量表达反转了细胞迁移能力增加的现象。

图:p16基因的超量表达对p16-dnmt的ptripz载体转染的细胞的细胞迁移能力影响分析

3. p16的特异dna甲基化促进rb的磷酸化作用和上调nfkb的p65亚基表达

为了确定p16的dna甲基化对下游通路的影响,作者通过western blot分析了p16-dnmt转染细胞在doxycycline处理下的变化,发现与无doxycycline处理相比,doxycycline处理下rb的磷酸化水平增加,nfkb的p65亚基表达上调。

注:在doxycycline处理下p16-dnmt转染细胞中rb磷酸化水平变化和nfkb的p65亚基表达变化

结论

p16的dna启动子区的cpg甲基化,引起p16基因表达失活,进而促进癌细胞的增值、迁移和侵染能力,从而确定p16的dna甲基化对肿瘤转移的驱动器作用。

参考文献:chenghua cui, ying gan,liankun gu,et al. p16-specific dna methylation by engineered zinc finger methyltransferase inactivates gene tranion and promotes cancer metastasis. genome biology, 2015, 16(1): 252.

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