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pacbio —— 离真理又进了一步

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浏览:- 发布日期:2017-02-16 12:36:03【 】

随着测序技术的快速发展,第三代测序技术正在逐渐走进人们的生活。但是关于它的很多具体知识,可能还有很多人不是很了解。那到底第三代测序技术能给我们带来什么,对生物学的发展意味着什么?这里小编为大家简单介绍一下。

1. pacbio测序原理

三代测序技术又被称为"single molecule real time (smrt™) dna sequencing"(单分子实时dna测序技术),该方法基于纳米孔的单分子读取技术,不需要pcr扩增即可快速读取序列。目前,pacific biosciences公司已经成功推出了商业化的第三代测序仪pacbio rs平台,它的测序流程如图(1)。

图1:pacbio完整流程

pacbio rs ii是pacific biosciences公司研发的单分子实时测序系统(single molecule real time, smrt),其专利的smrt cell含有15,000个纳米级的零模波导孔(zero-mode waveguides, zmws),每个zmw都能够包含一个dna聚合酶及一条dna样品链进行单分子测序,并实时检测插入碱基的荧光信号。

2 .pacbio 建库

三代测序不仅在原理上与不同,在建库流程上也有很大差异。pacbio建库流程如图(2)。关于pacbio建库的具体方案(样本打断,不同长度插入片段的建库流程方案(图3)),下一期小编再为大家整理。

图2 三代测序建库流程

图3 pacbio不同长度插入片段

3. pacbio的运用

(1)全基因组de novo

与最高不超过1kb的读长相比,pacbiors ii的长读长将有效解决短序列数据的拼接难题。同时,与二代测序的模板样品需要扩增相比,pacbio rs ii无需扩增可直接对单个分子进行测序,有效避免了pcr扩增偏好性和gc偏好性,pacbio rs ii可轻松跨越gc含量异常(过高或过低)及高度序列重复的区域,实现序列覆盖的完整性和均一性。

(2)基因组草图的优化或基因组完成图绘制

对已开展测序的动植物、微生物基因组结合三代长读长测序数据进行完善和提升。针对前期已经开展全基因组测序,获得基因组草图的动植物、微生物等,可以结合pacbio rs ii平台长读长reads进行补充,从而快速获得前期没有测得的信息及提升基因组的完整度。另外还可以针对前期没有检测获得的结构变异信息(structural-variation events)、串联重复序列信息(tandem duplication)、易位信息(inversion)等。尤其在微生物基因组完成图的绘制中,可在一天之内、成本低于$1,000即可将基因组完善获得0 gap contig。

(3)全长转录本测序

pacbio rs ii的长读长可实现全长转录本测序,并使基因可变剪接形式的识别成为可能,因此可以对新基因及其isoform进行更全面的研究。同时,长读长不再需要对rna-seq的reads进行组装,因此可以更完整的对基因模型和转录的基因进行更全面的注释,用以改进参考基因组中的基因注释信息。

(4)测序

长读长reads能够更为精准地鉴定水体、土壤、肠道等生境中微生物的种类的鉴定,能够更加快捷地获得更多微生物种的全基因组序列。

(5)16s rdna全长测序

pacbio rs ii的平均读长为8-10kb,而16s rdna长度大约为1540bp,因此结合该平台测序可以成功测序获得16s的全长序列。

(6)细胞器基因组测序

叶绿体基因组和线粒体基因组序列都包含重复序列、反向重复序列等复杂结构,pacbio rs ii的长读长可直接跨越这些区域获得这些细胞器的全基因组序列信息等,基因组组装不依赖于是否有近缘物种的线粒体和叶绿体基因组信息等、重测序能够检测到全面的snps及indel信息。

(7)全基因组重测序&稀有变异鉴定

pacbio rs ii长读长测序reads无gc偏号,能够全面获得基因组的遗传变异,包括snps的鉴定到cnv、sv结构变异等,可运用至人类癌症基因组重测序等。pacbio rs ii平台测序周期在10 hours小时即可完成测序,可应用至需要快速反馈的临床检测中,如细菌感染疾病中细菌的鉴定、病毒的鉴定等,取样开展重测序和目前已有的细菌、病毒基因组数据库进行比对鉴定即可。

(8)表观遗传学

pacbio rs ii利用测序过程聚合酶反应的动力学变化,首次实现对碱基修饰进行直接。当碱基有额外修饰时,dna聚合酶的合成速度会减慢,对应的信号会被检测出来。每种碱基修饰事件都会使聚合酶的“停顿模式”pacbio rs ii产生微小差异,最终反映到荧光脉冲信号的间隔上。除了甲基化修饰,还可以检测5-hc、5-hmu、5-hu、1-ma、6-ma、8-oxoa、bpde、6-mt、6-mg等碱基修饰,甚至可以鉴别传统亚硫酸氢盐测序法无法区分的甲基化修饰和羟甲基化修饰。pacbio平台可以在的同时即可检测表观遗传学修饰信息,只需对测序数据选择合适的软件即可分析碱基修饰信息。

4. pacbio技术特点

(1)利用过程聚合酶反应的动力学变化,首次实现对碱基修饰进行直接测序。

(2)超长的读长:平均测序读长能达到7,000-8,000bp,最长读长能达到30,000bp;

(3)准确率高:对基因组组装和基因组变异检测,可以最多达到99.999%的准确率;

(4)敏感性强:可以检测频率在0.1%的minor variants;

(5)无pcr扩增偏好性:样本不需要进行pcr扩增,避免了覆盖度不均一和pcr artifacts;

(6)最小的gc偏好性(gc bias):在极端高gc和极端低gc区域,可以轻松测定,从而保证序列的均匀覆盖度。

每一次测序技术的提升都会让我们更好更快的达到我们要的目标,都是让我们离真理又更近了一步。如果有满足不了你的地方,你还有选择,选择三代测序,选择pacbio,选择上海欧易生物


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