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如何制备高质量的血清、血浆用于mirna研究

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浏览:- 发布日期:2016-12-20 08:48:33【 】

人体内的血液循环系统犹如一条河流,流动的血液如同河水,身体所需的一切均由血液运送,身体产生的废物也由血液清运,可以想象血夜中的成份也是包罗万象。如果我们想了解人的生理状况取一滴血便可检验,但是做这些检测并非漫无目的,必须要知道哪一些物质是所谓的指针,在生物体内的这些指针就是我们熟知的生物标记(biomarker)。随着 microrna (mirna) 的研究的深入,人体已经发现超过2000个mirna,一些mirna参与调控人类基因的生理功能,伴随着检测技术的飞速发展,加上 mirna 相对于蛋白质标志的高稳定性,血液中的 mirna成为新一代生物标记的首要选择。

血液中的 到底是从何而来? 要往哪里去? 这些 mirna 的生理功能是什么?这三个问题是很多研究人员关心的问题,大量mirna相关研究表明,正常人血液中的 含量是极微量的,但是在病人和检材制备不佳的血液样本中却可抽取到大量的 mirna,这些现象表明,病人血清、血浆里面 mirna 的来源,很有可能是因疾病造成的组织坏死或细胞凋亡破裂而释放出来的胞内 mirna。下面为大家带来欧易生物提供的研究中血清、血浆制备方法:

1. 检体的制备:血清(serum)好还是血浆(plasma)好?

上图可以清晰地看出血浆比血清只是多了纤维蛋白原,血清和血浆都是来自血液检体的成分,制备方式的不同导致了各自成分有所差异。但是有文献报道,针对同一个人的血清和血浆样本抽提出来的 mirna 总量作比较,血清的抽提总量明显比血浆的抽提得率高,据推测这些 可能是因为凝血反应,血小板或红血球破裂后释出的物质也就是我们常说的溶血,因此从理论上来说,血浆适合作为生物标记寻找的来源。当然没有发生溶血现象的血清同样可以作为检体,所以样本制备过程中尽量避免溶血。

2. 检体制备方法

血浆

a) 采集外周血2ml,迅速转入edta 抗凝管中,涡旋或用移液器tip 混匀;

b) 在1小时(室温条件下)或2小时(4℃条件下)内进行下面的操作:4℃,820g(3000rpm)离心10分钟;

c) 吸约1ml上清转至洁净的1.5 ml离心管中,16,000g (13,200rpm), 4℃,离心10分钟,小心吸取上清到新的离心管中;

d) 放入-80℃冰箱中保存。

血清

a) 将血管内抽出的血液放入试管中,不加入抗凝剂;

b) 室温(22~25℃)放置30~60min血液标本自行凝结;

c) 凝血块周围所析出的淡黄色液体即为血清,小心吸取到收集管中,置于-80℃保存备用。

3. 检体的制备或保存不良是否可用?

血清或血浆中的 mirna可能来自胞内或胞外,尤其是血球(红血球或白血球等),因此处理方式不当会造成检体的污染,改变 mirna 的组成和表现量,造成研究结果的偏差,尤其红血球的溶血现象影响甚剧。因此制备检体时要避导致血球破裂的动作,如用太细的针头抽血、或检体保存不当造成溶血、或病人本身因疾病或治疗造成的败血或溶血现象也必须列入评估的考虑因素。此外抗凝血剂要避免使用含有肝素的凝血管,因为肝素会抑制反转录 (reverse tranion) 和聚合酶 (polymerase) 的反应,如果利用检体进行 q-pcr 的验证一定要避免。

(左图)为血清抽提 后,经由 agilent bioanalyzer 2100 分析的 rna 图谱,结果显示提出物中只有 mirna 片段的留存。(右图)同左图的实验操作步骤,结果显示提出物中除了mirna片段之外,还出现大片断的可疑dna 或 rna 片段,可能原始的检体中存在溶血等干扰因素影响。

4. mirna 的定量

在抽提成功的情形下,血清和血浆中仅含有少量的 mirna,1 ml 血清或血浆的抽提总量可能都在 ng 甚至pg 等级,这就意味着,运用现行的检测仪器如nanodrop来测 od 是不可行的,而agilent 2100 也仅能做到定性的检测,没法做精准的定量。通过agilent bioanalyzer 2100 的结果进行 mirna相对定量;或从等体积血清、血浆抽提出 mirna 再等比例取出进行实验,似乎是较可信的做法,但是还是要取决于实验的设计来决定。

由于的微量表达和个体的差异,要想寻找真正跟疾病状态相关的mirna标志物,就要求我们在样本制备环节多加小心,规避一些可能的干扰因素,如溶血、多次冻融、保存环境等,才能找到真正的mirna标志。

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