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升级版简化基因组技术:2b-rad

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浏览:- 发布日期:2016-09-27 09:46:13【 】

利用技术进行大规模高通量snp分型是当前国际上动植物基因组学研究热点。是指,采取限制性酶切将基因组dna进行片段化,选择其中的某些特征性片段,利用技术,可以进行基因组范围内高通量遗传标记的开发和分型。

目前广泛应用的技术是美国oregon大学发明的rad技术。但rad技术存在着两个主要的技术缺陷:1)繁琐的建库流程,其中涉及到多步的dna分离纯化过程,会对技术重复性、可靠性带来严重影响;2)rad技术产生的是长短不一的限制性dna片段,而由于pcr技术本身具有扩增模板长度偏好性(即优先扩增小片段dna),因而在经过建库阶段pcr及阶段emulsion pcr后,会严重影响扩增dna片段的基因组代表性。

2b-rad技术有效克服了上述rad技术存在的内在缺陷。2b-rad技术利用iib型限制性内切酶,通过基因组酶切产生等长的33-36bp的酶切标签,这些标签经过富集后用于下游的反应,通过生物信息学分析实现全基因组范围高通量snp筛查和分型分析。

2b-rad技术流程

  • 利用ii型限制性内切酶将基因组dna进行酶切;

  • 回收特定长度(33-35bp)酶切片段;

  • 连接接头;

  • 利用样品特异引物进行pcr扩增,扩增产物测序。

2b-rad技术优势

  • 全库测序,酶切位点无丢失:对基因组实现超高密度覆盖,信息更全

全库测序:对所有酶切下来的片段全部用于,不经过选择。

理论上,2b-rad标签在基因组上分布平均距离为2kb,根据实际项目经验估计在3-4kb。即1g大小基因组,可获得20多万标签。

  • 流程简单,技术重复性好:一个样品做两次结果高度可重复

n+1策略:每个项目默认会对其中的一个个体做一次技术重复(即同一个样品重复一次建库),承诺同一样品两次实验间标签重现率不低于95%,标记重现率不低于85%。

  • 标签深度均一:保证了每个标记的可靠性、准确性

如下图纵轴所示,不同标签测序深度非常平均。

拟南芥基因组 人类基因组

  • 标记数量更多:除snp之外,还可提供显性标记、cnv信息

传统的简化基因组技术仅能提供snp标记信息,还可以提供显性标记、cnv标记信息。

  • 标签具有独立性:降低数据冗余,提高信息含量

传统的简化基因组,会有很高的几率测到一个酶切位点两侧的序列,这种相邻的片段所提供的标记信息是完全连锁的,相当于数据的冗余。

2b-rad技术因为是切点在两侧,从原理上保证了几乎不可能出现两个标签完全相邻的情况,因此能提供更多的信息。

不同技术的比较

技术 gbs rad-seq ddrad
建库流程 不经物理打断、片段大小选择、末端修复 流程繁琐,涉及到片段选择、多步dna分离纯化 流程繁琐,涉及到片段选择、多步dna分离纯化 流程简便,不经物理打断、片段大小选择、末端修复
片段选择 200-800bp 300-500bp 300-500bp 33bp
酶切位点覆盖 部分 部分 部分 全部
技术重复性
标签密度控制 一般 灵活可控
标签测序深 相差很大 相差很大 相差较大 深度均一
标记类型 snp snp snp snp和显性标记
数据分析 对于重复序列造成的snp假阳性去除效果差 对于重复序列造成的snp假阳性去除效果差 对于重复序列造成的snp假阳性去除效果差 数据分型新算法(iml),可有效去除重复序列造成的snp假阳性

应用案例

4.1遗传图谱——2b-rad构建水产生物精度最高遗传图谱并进行qtl定位

本研究利用2b-rad技术,对栉孔扇贝f1代96个个体及其亲本进行测序,平均每个子代个体获得1m reads。构建了一张含有3,806个标记的遗传图谱,共19个连锁群,标记平均间隔0.41cm,这是水生生物已知精度最高的图谱。定位到两个生长性状qtl、一个性别qtl(0.37cm内)。

图1 栉孔扇贝遗传连锁图谱(部分)

[1].jiao w, fu x, dou j, et al. high-resolution linkage and quantitative trait locus mapping aided by genome survey sequencing: building up an integrative genomic framework for a bivalve mollusc. dna research, 2013, doi: 10.1093/dnares/dst043.

4.2群体进化——2b-rad进行21种果蝇系统发生关系研究

本研究利用2b-rad技术对21种果蝇进行了系统发生关系的阐述,一种iib型内切酶产生的2b-rad tag、16种iib型内切酶产生的 tag分别进行果蝇系统发生树的构建,其拓扑结构高度一致,表明简化基因组技术适合用于进行高准确度系统发生树的构建。

图2 基于 tag构建的21种果蝇系统发生树

[2].seetharam as and stuart gw. whole genome phylogeny for 21 drosophila species using predicted 2b-rad fragments. peerj, 2013, 1:e226.

4.3标记开发——进行拟南芥ril群体标记的分型

本研究构建了拟南芥的ril材料作为qtl定位的基础群体,利用2b-rad技术对75个ril群体进行了测序,共获得930个多态性标记,构建了拟南芥ril群体的高密度图谱。

图3 拟南芥ril群体全基因组分型结果图示

[3].fletcher rs, mullen jl, yoder s, et al. development of a next-generation nil library in arabidopsis thaliana for dissecting complex traits. bmc genomics, 2013, 14: 655.

2b-rad相关文章

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3.jiao w, fu x, dou j, et al. high-resolution linkage and quantitative trait locus mapping aided by genome survey sequencing: building up an integrative genomic framework for a bivalve mollusc. dna research, 2014, 21(1): 85-101. (if: 5.477)

4.fletcher rs, mullen jl, yoder s, et al. development of a next-generation nil library in arabidopsis thaliana for dissecting complex traits. bmc genomics, 2013, 14: 655. (if: 4.041)

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6.seetharam as and stuart gw. whole genome phylogeny for 21 drosophila species using predicted 2b-rad fragments. peerj, 2013, 1: e226. (if: 2.112)

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9.guo y, yuan h, fang d, et al. an improved 2b-rad approach (i2b-rad) offering genotyping tested by a rice (oryza sativa l.) f2 population. bmc genomics, 2014, 15(1): 956. (if: 3.986)

10.cui z, hui m, liu y, et al. high-density linkage mapping aided by tranomics documents zw sex determination system in the chinese mitten crab eriocheir sinensis. heredity, 2015, doi: 10.1038/hdy.2015.26. (if: 3.805)

11.dixon gb, davies sw, aqlyamova ga, et al. genomic determinants of coral heat tolerance across latitudes. science, 2015, 348(6242): 1460-1462. (if: 33.611)

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