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【微生物专题】——微生物多样性测序

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浏览:- 发布日期:2017-05-22 10:07:01【 】

在地球各种生境中,微生物表现出极大的多样性。然而由于纯培养法培养微生物的限制性,绝大多数种类的微生物并未得到了解。有数据表明,各种生境中大约只有1%的微生物是可培养的,多达99%的微生物在现有的实验条件和技术下尚未得到纯培养。

从国内外目前采用的方法来看大致包括以下几类:传统的微生物平板纯培养法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及dgge/tgge/ttge、t-rflp、sscp、fish、印记杂交、定量pcr、基因芯片等分子生物学方法。而近年来高通量技术凭借低成本、高通量、流程自动化的优势为研究微生物群落结构提供了新的技术平台。

微生物多样性测序基于第二代高通量技术对16s rrna/18s rrna/its等基因序列进行测序,能同时对样品中的优势物种、稀有物种以及一些未知的物种进行检测,获得样品中的微生物群落组成以及它们之间的相对丰度。

哪些研究需求可以做微生物多样性

(1) 物种丰度值检测:

  • 检测环境样本中的优势物种

  • 检测环境样本中的稀有物种

  • 检测特定的感兴趣的物种

(2) 不同分组样品相似性比较:

  • 样本间的相似性聚类

  • 不同来源的样本的差异性比较

(3) 寻找不同分组间的重要的biomaker

  • 统计分析寻找出引起不同分组差异的重要的微生物

  • 寻找潜在的微生物之间的关联性

(4) 其它的可与微生物多样性相关的分析

  • 外部环境的变化必然会带来微生物群落的变化,环境因子会带来哪些菌属的丰度变化,这些菌属(可能是有益菌、有害菌、功能菌)又给环境个体带来怎样的影响,这些均可做微生物多样性的检测。

测序区域选择

核糖体rna即rrna,占rna总量的82%左右。核糖体rna的编码dna序列中既有保守区又有可变区,保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系,而高变序列区域则能体现物种间的差异。

细菌和古菌

原核生物核糖体沉降系数约为70s,由50s和30s两个亚基组成。50s大亚基含有两种rna分子,相对分子质量大的rrna的沉降系数为23s,相对分子质量小的rrna为5s。30s小亚基含有一个16s的rrna分子。因此原核生物的rrna分三类:5srrna、16s rrna和23srrna。

1977年,carl woese就是根据16s rrna 的系统进化关系图,提出了著名的三域学说,并且提出了古菌这一说法。在 16s rrna 分子中,不但含有高度保守的序列区域,又有中度保守和高度变化的序列区域,因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。16s rrna 的相对分子量大小适中,约1540bp,含有足够多的信息以便于亲缘关系研究;5srrna 太短;而23s rrna 的序列相对于当时的技术显得有点过长。

16s rrna全长

真菌18s 和its 区域

真核生物80s核糖体中包含4种沉降系数不同的rrna,其中,40s核糖体亚基(小亚基)中包含18s rrna,而60s核糖体亚基(大亚基)中包含5s rrna、5.8s rrna和28s rrna。即真核细胞核糖体中通常含28s、18s、5.8s和5s 四种rrna;真核细胞中的18s rrna是16s rrna的同源rna,其相对分子质量约为0.7 mda,长度约为1900 nt。18s rrna除了比16s rrna稍长且多一些臂和环结构外,两者空间结构十分相似,在核糖体中起到的作用也基本相同。

内转录间隔区(internal transcribed spacer, its)位于18s、5.8s及28s之间,由于不需要加入成熟核糖体,因此在进化过程中能够承受更多的变异,其进化速率为18s rdna的10倍,属于中度保守的区域,其保守性基本上表现为种内相对一致,种间差异比较明显。

引物序列选择

对于微生物多样性,建议选择如下扩增引物:

随着三代仪的普及,也可以利用三代测序进行 16s rdna 全长测序,利用的引物组合为 27f 和1492r。

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