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项目文章 | 欧易客户通过mirna芯片技术发现外泌体途径诱导上皮性卵巢癌发展的作用机制

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浏览:- 发布日期:2018-11-20 10:23:13【 】

基本信息

论文题目:exosomes released from tumor-associated macrophages transfer mirnas that induce a treg/th17 cell imbalance in epithelial ovarian cancer

发表期刊:cancer immunology research

发表时间:2018.11

影响因子:9.188

通讯作者:上海交大医学院 汪希鹏教授、林盈盈博士

本文涉及的高通量技术:安捷伦mirna芯片(由欧易生物提供服务)

研究背景

免疫微环境由肿瘤相关巨噬细胞(tams)和t淋巴细胞组成,后者包括调节性t细胞(tregs)和t细胞助手17细胞(th17),免疫微环境对上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,eoc)的发展具有重要作用。treg/th17细胞不平衡与系统性红斑狼疮、糖尿病、肿瘤等多种疾病有关。研究发现tams能够产生外泌体作用于微环境中毗邻的细胞,但是eoc免疫微环境中外泌体及其转运的mirna的具体功能和作用机制仍是未知的。

研究内容

基于tams细胞来源的外泌体mirna芯片分析,作者发现了mir-29a-3p和mir-21-5p高表达。将两种类型的mirna mimics转染到cd4+ t细胞,发现其抑制stat3的表达,并造成treg/th17失衡。

结果表明,外泌体能够调节tams细胞和t细胞的相互作用,产生的免疫抑制性微环境能够促进eoc肿瘤细胞的生长和转移。分析tams细胞来源的外泌体及其相关mirna能够为eoc新的治疗方法奠定基础。

 

研究思路

研究结果

1.eoc患者组织中treg/th17发生了上调

选取124个eoc患者和26个良性卵巢肿瘤患者的卵巢组织样本,通过免疫荧光检验发现与良性卵巢肿瘤患者相比,eoc患者的初期肿瘤组织和转移性腹膜组织treg/th17均显著升高。



图1 |(e)eoc组织(n=124)和良性卵巢肿瘤组织(n=26)treg/th17的比率对比;eoc腹膜组织(n=15)和良性腹膜组织(n=6)treg/th17的比率对比

2.treg/th17失衡对卵巢肿瘤生长和转移的影响

利用id8细胞系构建转移性卵巢癌c57bl/6模型,体内实验发现treg/th17的比率升高能够促进肿瘤细胞的生长,也能够促进肿瘤细胞的转移。

图2 |(c)向c57bl/6小鼠腹腔内注射id8-luc-pur细胞,用荧光成像系统发现高treg/th17比率能够显著增加肿瘤的载量;(g)用伊红(hematoxylin-eosin)对肿瘤细胞进行染色,实时成像后发现肿瘤细胞遍布整个腹腔

3.m2巨噬细胞产生的外泌体能够诱导treg/th17失衡

诱导tam分化成m1和m2两种类型的巨噬细胞,未处理的巨噬细胞作为对照,分别与cd4+ t细胞进行共培养,发现tams细胞能够诱导treg/th17的失衡。各自分离外泌体后再次与cd4+ t细胞进行共培养,发现tams细胞产生的外泌体能够诱导treg/th17失衡。



图3 |(b)三组中treg/th17的比率;(f)三组巨噬细胞分离得到的外泌体分别与cd4+ t细胞共培养三天,th17和treg细胞的比例通过流式细胞分析确定,并计算treg/th17

4.外泌体mirnas通过靶向stat3来诱导tregs/th17失衡

安捷伦mirna芯片分析发现,m2巨噬细胞分泌的外泌体中有42个mirnas发生了上调和10个mirnas发生了下调,其中有五个上调s和一个下调mirnas与t细胞分化有关。将mirna mimics转染到cd4+ t细胞,发现只有hsa-mir-29a-3p和hsa-mir-21-5p能够改变tregs/th17。

western blots和rt-pcr分析发现过表达hsa-mir-29a-3p和hsa-mir-21-5p导致cd4+ t细胞的stat3蛋白及其mrna都发生下调。rt-pcr和流式细胞检测分析进一步发现,细胞因子il4、il6和tnfα下调,抗炎细胞因子tgfβ和il10上调。以上因素造成eoc肿瘤微环境失衡,最终导致肿瘤的发展。



图4 |(a)thp-1和thp-1诱导得到的m2巨噬细胞分泌的外泌体中mirna表达heatmap图;(b)和t细胞分化相关的mirna;(d)将hsa-mir-21-5p和hsa-mir-29a-3p mimics转染到cd4+ t细胞,流式细胞检测th17和treg细胞的比例,并计算treg/th17;(e)western blot观察th17和treg细胞stat3蛋白表达量;(g)rt-pcr观察th17和treg细胞stat3 mrna的表达量;(j-k)cd4+ t细胞受到hsa-mir-21-5p和hsa-mir-29a-3p mimic转染或敲降后,tregs细胞因子tgfβ、il10和il4以及th17细胞因子tnfα和il6的表达量

5.mmu-mir-29a-3p和mmu-mir-21-5p对卵巢肿瘤转移的影响

向小鼠腹腔注射id8-luc-pur细胞,再次构建转移性卵巢癌c57bl/6模型,利用生物成像系统观察肿瘤的生长情况,发现mmu-mir-21-5p-mimic和mmu-mir-29a-3p-mimic组肿瘤载量显著增加。收集小鼠的腹膜、肠系膜和膈膜,利用实时成像技术观察肿瘤的转移情况,发现mmu-mir-29a-3p和mmu-mir-21-5p能够促进肿瘤的生长和转移。

图5 |(c)向小鼠腹腔注射id8-luc-pur细胞,10周后利用生物成像系统检测肿瘤细胞的荧光强度(cps);(f)10周后小鼠腹腔的成像情况

6.treg/th17失衡与eoc分级和患者存活率有关

利用roc曲线比较treg/th17在eoc患者中的灵敏性和特异性,treg/th17对临床上eoc患者的总生存率具有很好的预测价值。利用tcga数据库分析treg/th17和eoc患者的相互关系,得出treg/th17与eoc的组织学分级有关,并且是一个独立的预后指标。

图6 |(a)roc曲线反映treg/th17比率在eoc患者中的灵敏性和特异性;(b)基于treg/th17不同比率(大于1.02和小于1.02)的eoc患者存活率情况;(c)tcga数据库中467个eoc患者的treg/th17和总生存率(os)的关系;(d)tcga数据库中467个eoc患者mir-29a-3p和mir-21-5p表达量与os的关系

总结

来自tams的外泌体向cd4+ t细胞转运hsa-mir-29a-3p和hsa-mir-21-5p,通过直接靶向stat3,导致treg/th17失衡,诱导eoc肿瘤的生长和转移。

图7 | tams通过外泌体诱导eoc肿瘤发展的途径

 

参考文献

zhou j, li x, wu x, et al., (2018). exosomes released from tumor-associated macrophages transfer mirnas that induce a treg/th17 cell imbalance in epithelial ovarian cancer. cancer immunology research. doi: 10.1158/2326-6066.cir-17-0479

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本文系欧易生物原创

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