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项目文章 | 欧易生物免疫组库测序技术助力肝再生机制研究

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浏览:- 发布日期:2018-09-26 09:51:12【 】

前言

今天,小编为大家分享的文章,是由欧易生物与免疫组库研究专家团队经过密切合作,通过技术及利用生物信息学方法对高通量后的大数据进行分析,成功总结出的疾病模型下免疫组学核心算法。

相关研究成果已发表在hepatology(if=14.079)等高影响因子杂志。

基本信息

英文标题:intrahepatic t cell receptor β immune repertoire is essential for liver regeneration

中文标题:肝内t细胞受体β免疫组库对肝再生是必需的

发表期刊:hepatology

发表时间:2018.04

影响因子:14.079

研究目的:tcrβ免疫在肝再生中的作用

研究样本:c57bl/6(野生型小鼠4例),tcrb-/-(tcrβ 链缺失的部分肝切除小鼠4例), tcrbad-cre(通过cre重组得到的tcrβ链缺失的部分肝切除小鼠4例)

研究技术:tcr β测序,免疫组化,免疫荧光,wb,rt-qpcr,流式细胞,细胞因子检测

研究结果

1. tcrβ缺失导致肝再生受损

免疫组化分析证明tcrβ链在tcrb-/-和tcrbad-cre小鼠中缺失。这两种tcrβ链缺失小鼠在接受部分肝切除术后,其肝脏在外观、大小、重量上和野生小鼠的没有明显差异,但是血清转氨酶水平(肝损伤指数)、空泡样变性肝细胞、肝-体比重等明显降低(fig. 1a-d)。此外,相比于野生小鼠,tcrb-/-和tcrbad-cre小鼠的肝细胞增值急剧减少(fig. 1g, h),肝细胞凋亡提高(fig. 1e, f)。这些数据表明tcrβ对肝细胞增殖和肝再生是必不可少的。

fig 1. tcrβ对肝再生是必须的

 

2. 肝切除后tcrβ缺失引发异常的炎症环境

tcrβ缺失急剧降低炎症因子的表达,包括炎症信号通路p-stat3(fig. 2a, b)、以及细胞因子il-6、il-4、tnf-α(fig. 2c)在tcrb-/-和tcrbad-cre小鼠中的表达量明显低于野生小鼠,il-17在tcrb-/-中的表达量升高了(fig. 2c),ifn-γ和il-22没有明显变化(fig. 2c)。上述结果表明tcrβ缺失引起了肝内异常的炎症反应,从而影响了肝再生过程。

 fig 2. 肝再生过程tcrβ缺失削弱炎症激活反应

 

3. 体外实验表明肝内免疫微环境调控肝细胞增殖

将小鼠永生花肝细胞系(nctc1469)和从野生小鼠肝脏切除前后分离的肝内免疫细胞(或αβ t细胞)进行共培养,结果发现,肝脏再生前后αβ t细胞对肝细胞增殖活性没有影响。相反,从肝切除tcrb-/-小鼠分离的免疫细胞与小鼠正常肝细胞(nctc1469)共培养后,肝细胞增值和ki67表达明显降低(fig. 3a-d);而且肝细胞凋亡加剧(fig. 3e, f)。western blot结果进一步发现,细胞周期蛋白d1和p-stat3的表达水平降低,caspase3的表达水平升高(fig. 3g, h)。这些结果表明肝细胞增殖和凋亡是受肝内免疫微环境的调控,而不只是αβ t细胞的调控。

fig 3. 肝内免疫微环境调控肝细胞增殖和凋亡(体外实验)

 

4. tcrβ影响免疫细胞的激活

作者进一步研究tcrβ缺失是不是通过影响相关免疫亚群的富集和激活而影响肝再生。tcrb-/-小鼠在肝再生过程中t细胞总数急剧减少,其中αβ t细胞的变化可忽略,但是γδ t细胞的数量显著上升(fig. 4a-c)。其他免疫细胞亚群(如nk/nkt和 kupffer细胞)没有显著变化。那么,肝切除后免疫细胞亚群有何变化呢?γδ t细胞分泌的il-17和il-22在tcrb-/-小鼠的表达量高于野生小鼠(fig. 4d, e),活化的部分nk和nkt细胞(cd69+, nk1.1+)在tcrb-/-小鼠的表达量高于野生小鼠(fig. 4f, g),kupffer细胞分泌的il-6和tnf-α的表达量反而下降(fig. 4h, i)。上述结果表明tcrβ缺失会选择性激活nk、nkt和kupffer细胞,减少稳定型nkt细胞,导致肝再生过程中γδ t细胞扩增,显著削弱肝内免疫细胞的活化。

fig 4. 肝再生过程tcrβ缺失引发异常的免疫微环境

 

5. 肝再生过程中vβ和jβ基因解析

肝内αβ t细胞在野生小鼠肝切除后急剧增加(fig. 5 a, b),对肝切除前和切除6h后的肝内淋巴细胞进行tcrβ测序,共鉴定到23个不同的v基因和13个不同的j基因。频率最高的v基因是trbv13-2(肝切除前后分别是17.82%和20.76%)和trbv1(肝切除前后分别是17.67%和20.43%),频率最高的j基因是trbj2-7(肝切除前后分别是24.60%和22.79%)和trbj2-5(肝切除前后分别是14.52%和12.84%)(fig. 5 c)。

fig 5. 肝切除前、后(6h)v基因和j基因分布和丰度

v 基因和j基因的使用频率在肝切除前后比较类似(fig. 5 d, e),但是某些v基因在肝切除后发生了显著变化,包括trbv1、trbv13-2、trbv12-2、trbv3和trbv5(fig. 5f)。v-j对在肝切除前后没有显著差异(fig. 6a, b),只有16个v-j对(5.51%)在肝切除前后有显著变化(fig. 6c, d)。

fig 6. 肝切除前、后(6h)v-j对的分布和丰度

6. 肝切除导致cdr3氨基酸多样性偏低

cdr3氨基酸克隆型直接决定tcrβ的多样性,本研究在肝切除前后共获得418,944种cdr3氨基酸克隆型。长度为14个氨基酸的cdr3在肝切除后的使用频率高于肝切除前(fig. 7a)。虽然总的cdr3氨基酸克隆型在肝切除前后比较类似,但是肝切除后高频cdr3氨基酸克隆型(阈值>0.008%, p<0.05)(fig. 7b, c)和独有的cdr3氨基酸克隆型比例明显减少(fig. 7d)。基尼系数、香农指数、rank-abundance分析都表明肝切除后cdr3氨基酸多样性降低(fig. 7e-g)。上述结果表明肝切除后几个关键的高频cdr3氨基酸的使用频率了发生变化,而且tcrβ免疫组库多样性降低。

fig 7. 肝再生过程cdr3氨基酸克隆型分析

 

小结

基于高度异常的炎症微环境和免疫微环境,在肝再生过程中,适应性免疫像是“指挥官”而不是“执行者”。同时,除了免疫状态,不能排除还存在tcrβ调控肝再生的其他机制。因此,需要进一步研究其他可能的调控机制,以及tcrβ在肝再生过程如何和其他免疫细胞合作。

fig 8. 肝再生过程αβ t细胞通过tcrβ重排调控免疫微环境

文章亮点

第一次展示肝再生过程中tcrβ免疫组库的多样化和弱化的免疫状态,该结果至少部分说明tcrβ缺失导致肝再生发生缺陷。

 

参考文献

qing liang, zeyuan liu, chao zhu, et al. intrahepatic t cell receptor β immune repertoire is essential for liver regeneration. hepatology. 2018. doi: 10.1002/hep.30067

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lisa  撰文

本文系欧易生物原创

转载请注明本文转自欧易生物

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