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用单分子直接测序技术深入了解茶树次生代谢通路基因的转录组分析

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浏览:- 发布日期:2017-12-27 15:43:51【 】

样本数:共8个(顶芽,初茬,成熟叶,落叶,茎,花,果和根)

每个样本按照<1,1-2,2-3,3-6 kb的方式使用bluepippin分开建库,一共7个cell

使用rsii平台

下图为smrt analysis流程分析过程。

smrt analysis流程分析过程

最后将通过smrt analysis流程分析得到的四个库的hq(高质量序列,质量达到99%以上)数据合并。以下为smrt analysis流程分析结果:

通过cd-hit-est(c=0.98)去冗余,得到非冗余全长转录本序列,91,638条 hq全长转录本去冗余结果:

非冗余转录本序列长度分布:

对非冗余全长转录本做注释

5大注释交集结果:

80,217条isoform各个数据库一共注释上了90.86%

go注释结果

x轴表示转录本数量,y轴表示go功能分类

cog注释结果

x轴表示转录本数量,y轴表示cog功能分类

kegg注释结果

x轴表示转录本数量,y轴表示kegg功能分类

本文主要研究的茶树的三个kegg通路图如下,并通过cd-hit-est(c=0.9)聚类得到候选unigene

a类黄酮合成通路,b茶氨酸合成通路,c咖啡因合成通路。每个基因后括号内的数字表示在茶树中鉴定的unigenes的数目。

文中通过unigene定性分析通路中基因的前后关系,以及将isoform比对到genbank中得到同源序列信息,来进一步理解这三个通路。

再通过将聚类到一起的isoform比对到bac库中的genome序列上,然后通过gene structure display server软件显示可变剪切,来研究这三个通路上的可变剪切,并通过pcr试验验证原本注释只存在一个转录本,但是此次研究却发现多个转录本的那些isoform。结果发现挑选出的isoform通过pcr得以验证。

可变剪切图和pcr验证图

左侧为pcr验证结果;右侧为可变剪切结果,其中蓝色粗线为外显子区,黑色细线为内含子区

将此次研究结果和以前通过二代得到的实验研究结果相互比较发现:pacbio isoform可以改善短数据组装结果。

blast比较二代、三代得到的unigenes

x轴为三个通路上的基因,y轴为二代、三代高度一致的unigenes的百分比

从图上可以二代、三代数据看出有较好的一致性。

二代、三代数据得到的genes长度分布比例比较

蓝色为pacbio数据,橙色为illumina数据,x轴为长度分布,y轴为genes数量所占的百分比

上图可以看出三代数据得到的genes长度长的要比二代数据多,因此,得到的genes可能更加的完整。

另外,文献中提到发现了少量二代数据得到的unigenes与三代数据得到unigenes具有部分同源性,但是二代的unigenes却有2个完整的cds区,意味着二代数据容易误装。

综上,三代得到的有效转录本具有改善茶树转录组特性;可变剪切的鉴定可以推断编码的蛋白质的性质和评估剪接变体在基因调控中的作用;而本次研究也提供了更准确的基因转录描述,并在未来将大大改善茶树基因组注释。

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