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质粒抽提的那些小事

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浏览:- 发布日期:2017-01-20 15:16:56【 】


质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中,是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状dna分子。而在现在的分子生物学试验中我们会涉及到各式各样的质粒,而接触到质粒时不可避免的就会涉及到质粒的抽提。由于质粒抽提成本不高,因此大多数的实验室都选择了用公司提供的抽提试剂盒来抽提质粒,这也就导致了很多人并不是很了解质粒抽提的原理。那么今天小编就带大家简单了解一下质粒抽提的基本原理,以及抽提过程中的一些小事。



现在市面上的质粒抽提试剂盒基本用的都是碱裂解法,

因此我们就来了解一下这类试剂盒的抽提原理。

这类试剂盒中都会有提供主要的三种溶液,

当然每个试剂公司都会有不同的命名,

我们就按加入顺序命名为

溶液1,溶液2,溶液3

(当然还有用来后续清洗杂质的酒精溶液等试剂在这里就不做过多讲解了)。



溶液1

主要成分50 mm葡萄糖 / 25 mm tris-cl / 10 mm edta,ph 8.0。主要的作用是用来重悬沉淀的菌体。其中葡萄糖的作用其实只是为了不让重悬的菌体过快的下沉。tris-cl其实就是一种缓冲液,可以使溶液ph值稳定在8左右。edta的作用主要是为了抑制dnase的活性,以及抑制菌体生长。当然溶液1中还需要加入rnase a,用来去除抽提过程中的rna污染。其实这样看来溶液1的作用其实只是起到了稳定重悬的作用。当然重悬一定要充分,不能看到一点的块状,目的就是要将菌体充分打散。


溶液2

主要成分0.2 n naoh / 1% sds。溶液2也可以被称为裂解液,所谓碱裂解法的碱就是这里的naoh。naoh是最佳的溶解细胞的试剂,不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞,碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解,这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。那sds是干啥用的呢,其实这一步的裂解sds并没有发挥什么作用,主要是为了下一步蛋白沉淀所做的铺垫。在裂解这一步骤中所有的试剂盒都会写到轻微颠倒混匀,以及不要反映超过5分钟,虽然naoh有裂解细胞的作用,但是剧烈混匀或是裂解时间过长,会导致naoh将细菌中的基因组染色体打开并打断,这样就会导致基因组dna溶解到裂解液中,并且后期无法将二者分开,这就造成最后的质粒会有基因组污染。


溶液3

主要成分3 m 醋酸钾 / 2 m 醋酸。既然长时间的碱性环境会导致基因组污染,那就用酸中和一下,这里的醋酸就是起到中和naoh的作用的。而这一步的白色絮状沉淀又是怎么来的呢。还记得溶液2中的sds吗,这其实是十二烷基磺酸钠(sds)遇到钾离子后变成了十二烷基磺酸钾(potassium dodecylsulfate, pds),而pds是水不溶的,因此发生了沉淀。而sds又有结合蛋白质的能力,因此这样就能将菌体中的蛋白质都沉淀下来了。


加完了以上三个溶液后就能通过离心将基因组染色体以及蛋白沉淀下来,上清中就含有目的质粒,接下来就是将上清过柱,该步骤的目的就是清洗以及回收质粒dna。


现在是不是对于质粒的抽提有了更加清楚的了解?通过上面的介绍我们不难发现其实最重要的是溶液2。质粒抽提得率低大多也和这一步有很大的关系。那么我们就来聊聊溶液2会带来的那些问题吧。




首先溶液2不能长时间开盖暴露在空气中,因为co2会和naoh反应变成碱性较弱的na2co3这样会使得裂解的效果变差,因此如果溶液2是一大瓶的话,最好是将其分装几瓶。

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在低温时溶液2会产生沉淀,这是由于sds析出,只需37度温浴片刻即可。

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最后在加入溶液2后一定要确保溶液变得澄清,溶液澄清就说明细胞裂解完全,反之则不充分,而裂解不充分则会导致质粒的抽提得率低,因此在使用的菌体起始量高时需要加大这3个溶液的用量以确保菌液彻底裂解。



以上就是小编所总结的

质粒抽提的那些事,

希望对大家以后的实验能有所帮助。

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