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2b-rad的十大技术应用总结(下篇)

2016-10-24 09:28:56 

2b-rad,革新的划时代简化基因组技术,以其高可重复性、全库测序、测序深度均一、标签独立性好等各项优势,不仅技术方法刊登在《nature methods》上,也广泛受到研究工作者的好评,近年来陆续发表多篇文献在各大期刊上。

我们作为发明方独家授权合作的专业技术服务商,今天将继续带来『细菌分型、标记开发、多组学分析联合的性状解析、突变体基因定位』的分享。

应用7:细菌分型

研究背景:单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)是一种食源性致病菌,这类菌最常用的分子分型方法之一是多位点序列分型(multilocus sequencetyping,mlst)。mlst 分型方法选用多个管家基因进行序列分析, 由于管家基因具有序列高度保守的特点, 因此该方法在同一血清型内分型的分辨力较差。高通量测序与mlst技术的结合,可以大大减少劳动力和成本。

研究内容:为了建立一种在食品环境中,简单、快速和低成本的细菌分型方法,意大利研究人员成功将简化基因组技术,2b-rad应用到单核细胞增生李斯特菌的分型,并将该技术与传统的mlst做了比较,结果表明:2b-rad技术的菌株分型精确度明显优于传统的mlst技术。

图1 两种方法分型结果对比

研究策略

  • in silico:从数据库下载30个单核细胞增生李斯特菌基因组,对其进行insilicomlst和2b-rad分析。

  • laboratory experiments:从食物或食物加工点分离到58株单核细胞增生李斯特菌,同时进行mlst和2b-rad研究。

研究结果

  • 2b-rad可以预测mlst分型结果;在群落结构方面,能比mlst提供更多信息(图1)。

  • mlst技术分型相同,而2b-rad分型不同的单核细胞增生李斯特菌,这些不同的菌株大多数都是映射在李斯特菌的非核心基因组部分,因此,2b-rad可以提供更多信息,如致病性、抗胁迫。

参考文献

pauletto m, carraro l, babbucci m, et al. extending rad tag analysis tomicrobial ecology: a comparison between multilocus sequence typing and 2b‐rad to investigatelisteria monocytogenes genetic structure[j]. molecular ecology resources, 2015. (if: 3.712)

应用8:标记开发

研究背景:鉴定数量性状位点和特定等位基因的变化,对研究进化的生物学家和育种家来说是一个重要目标。近等基因系(near-isogeniclines, nil)是确定qtl的理想材料,它能提供精确的qtl位点,并最终发现相关基因。

研究内容:本研究构建了拟南芥的ril(recombinant inbred line, ril)材料作为qtl定位的基础群体,利用2b-rad技术对75个ril群体进行了测序,共获得930个多态性标记,构建了拟南芥ril群体的高密度遗传图谱。

图1 夜间叶片电导率的qtl定位

研究策略

  • 实验材料:75个拟南芥ril群体。

  • 基因分型:按照2b-rad文库构建流程,alf i内切酶进行酶切,最小等位基因频率(minor allele frequencies, maf)<1%,认为是纯合;maf>25%认为是杂合。亲本20x,子代10x。

研究结果

  • 本研究为十字花科的群体研究构建了一个全新的、有用的nil群体,它能快速、精确定位候选qtl位点。这是由于高密度的标记和基因组范围内的基因渗透,使得nil群体有利于发现与复杂性状相关的重要基因,这对农业和生态都具有重要意义。

  • 夜间叶片的电导率是一个遗传力较弱的性状,本研究成功将该性状相关的qtl位点定位在1号染色体上约3mb的区间内(图1)。

参考文献

fletcher r s, mullen j l, yoder s, et al. development of a next-generationnil library in arabidopsis thaliana for dissecting complex traits[j]. bmc genomics, 2013, 14(1): 655. (if: 3.986)

应用9:多组学分析联合的性状解析

研究背景:双壳贝类是全球海水养殖的重要种类,但双壳贝类研究基础比较差。虽然已经有部分种类进行了遗传图谱的绘制,但这些图谱普遍精度较差(10~20cm),因此远不能满足进行qtl精细定位的需求。

研究内容:本文以栉孔扇贝为研究对象,利用2b-rad技术构建了水产生物中目前已知密度最高的遗传连锁图谱(~0.41cm)。在此基础上,针对几个重要的生长性状和性别相关位点分别进行了qtl定位,并通过将连锁图谱与基因组survey数据、转录组数据、bac物理图谱的联合分析进行相关功能基因的发掘,首次全面地展示了如何在非模式生物上搭建一个整合的基因组学研究平台。

图1 亲本与f1代标签数量对比

图2 qtl定位结果

研究策略

  • 实验材料:2个亲本,96个f1代个体。

  • 文库构建:为了降低成本,仅对两个亲本进行了全基因组的2b-rad标签测序;而对于96个f1个体,文库构建时利用选择性接头(5’-nnt-3’)进行了标签的选择(选择比例大约为10%,图1)。

  • 数据分析:两个亲本获得~20m reads,标签平均深度70-80x;子代个体获得0.6~1.2m reads,标签平均测序深度16.75x。从两个亲本中共鉴别到7458个多态性标记,其中6842个标记在至少一个亲本为杂合(2196个共显性标记和4646个显性标记),利用其中符合孟德尔分离比的4881个标记导入joinmap 4.0软件进行遗传图谱的绘制。雌性遗传图谱共包含2025个标记,图谱总长度1175.4 cm,标记平均间隔0.59 cm;雄性遗传图谱共包含1861个标记,图谱总长度1154.9 cm,标记平均间隔0.62 cm。整合图谱中共包含3806个标记,图谱总长度1543.4 cm。

  • 基因组低覆盖度survey:利用solexa平台对一个二龄的扇贝个体测序了62.4gb数据,约合52x基因组覆盖。拼接后获得数目较多的scaffold(n50=1.5kb),其中长度最大的scaffold达到46kb;scaffold总长度达到870 mb,覆盖栉孔扇贝全基因组的70%。将栉孔扇贝的转录组测序数据与基因组scaffold进行了比对,20056个isogroup中有91.3%的可以比对到16489条scaffold上,表明基因组预测序结果中已经包含了大部分基因。

研究结果

  • 所构建的扇贝图谱应该是目前已知水产生物上精度最高的图谱,标记平均间隔0.41cm。

  • 以遗传图谱为基础,针对栉孔扇贝的几个主要的生长性状和性别分别进行了qtl定位,定位结果如图2。其中生长性状共定位到两个qtl,分别位于1号和3号连锁群上;性别相关基因被锁定到11号连锁群上一个0.37 cm的区间。

  • 同时,由于2b-rad技术所获得标记数目非常多,因此还可以进行全基因组关联分析。全基因组关联分析结果与qtl定位结果大体一致。

  • 以遗传连锁图谱为基础,可以辅助进行基因组scaffold的拼接。本文中将遗传连锁图谱、基因组scaffold、bac物理图谱进行整合。遗传图谱上的3806个标记中,有2174个可以定位到scaffold上。

  • 正是因为有了基因组scaffold的辅助,因此可以对定位的qtl区间进行注释。本文所定位到的两个生长性状qtl,其中位于3号连锁群上的qtl中,有一个标记f 68558位于prop1基因的内含子中。prop1基因是一个非常重要的转录因子编码基因,它会参与生长因子的调节。之前在家畜研究中的报道表明,prop1基因与牛、山羊、绵羊的生长性状相关。prop1基因在栉孔扇贝中的作用有待于进一步的实验研究。

  • 同样,利用基因组scaffold,在定位到的性别qtl中,有一个标记(f93422)位于转录因子基因znfx1中,而河豚中的研究表明znfx1基因与性别决定基因amhr2紧密连锁。

参考文献

jiao w, fu x, dou j, et al. high-resolution linkage and quantitative trait locus mappingaided by genome survey sequencing: building up an integrative genomic frameworkfor a bivalve mollusc[j]. dna research,2014, 21(1): 85-101.

应用10:突变体基因定位

2b-rad和mbs联合,即2b-rad代替重测序,与mbs联合进行基因定位。

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