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微观的世界,多样的你

2016-05-18 09:44:00 


在地球各种生境中,微生物表现出极大的多样性。微生物群落在地球生物化学循环中起着非常重要的作用,它是营养循环、生物地化循环及天然和人源废物降解的主要驱动者。

然而由于纯培养法培养微生物的限制性,绝大多数种类的微生物并未得到了解。有数据表明,各种生境中大约只有1%的微生物是可培养的,多达99%的微生物在现有的实验条件和技术下尚未得到纯培养,其中的微生物和基因资源蕴含着巨大的应用潜能。新的技术方法亟待发现,用以揭示微生物群落遗传结构和功能的多样性。

分子生物学方法的发展使得人们对环境微生物群落的组成和生理有了更深刻的认识。尤其是随着高通量测序、基因芯片等新技术的不断更新,微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。

微生物多样性的研究方法有很多,从国内外目前采用的方法来看大致包括以下几类:传统的微生物平板纯培养法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及dgge/tgge/ttge、t-rflp、sscp、fish、印记杂交、定量pcr、基因芯片等分子生物学方法。而近年来高通量测序技术凭借低成本、高通量、流程自动化的优势为研究微生物群落结构提供了新的技术平台。

微生物多样性测序基于第二代高通量技术对16srrna/18srrna/its等基因序列进行测序,能同时对样品中的优势物种、稀有物种以及一些未知的物种进行检测,获得样品中的微生物群落组成以及它们之间的相对丰度。探讨微生物多样性对于研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用有着重要的理论和现实意义。

第二代技术优势

无需培养分离菌群:

直接对环境样本中扩增核糖体rna高变区进行测序,解决了大部分菌株不可培养的难题。

客观还原菌群结构:

专业、成熟、稳定的样本制备流程,严格控制pcr循环数,客观还原样品本身的菌群4

结构及丰度比例。

痕量菌检测:

充分发挥高通量测序的大数据量优势,能检测出丰度低至万分之一的痕量菌。

目前欧易生物选用miseq平台,进行微生物多样性研究。

此项技术的优势:

原核生物rrna分三类,5srrna16srrna23srrna

1977年,carl woese就是根据16s rrna的系统进化关系图,提出了著名的三域学说,并且提出了古菌这一说法。在16srrna分子中,不但含有高度保守的序列区域,又有中度保守和高度变化的序列区域,因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。

16srrna的相对分子量大小适中,约1540bp,含有足够多的信息以便于亲缘关系研究;5s太短;而23s的序列相对于当时的测序技术显得有点过长。

真核细胞中的18srrna是16s rrna的同源rna,其相对分子质量约为0.7mda,长度约为1900 nt。18s rrna除了比16srrna稍长且多一些臂和环结构外,两者空间结构十分相似,在核糖体中起到的作用也基本相同。

由于18s rdna在进化速率上比较保守,因此在系统发育研究中较适用于种级以上阶元的分类。内转录间隔区its位于18s、5.8s及28s之间,由于不需要加入成熟核糖体,因此在进化过程中能够承受更多的变异,其进化速率为18srdna的10倍,属于中度保守的区域,利用它可研究种及种以下的分类阶元。另外,也可通过选择引物同时扩增18srrna和its,通过分析18s rrna序列,先在较高级别上确定样品的归属,然后根据its 序列,将真菌归类到种或亚种水平。

itsi和itsii是中度保守区域,其保守性基本上表现为种内相对一致,种间差异比较明显。这种特点使its非常适于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。

可检测的样品:

土壤、底泥:5-10g

土壤可采用多点采用法进行土壤样品收集,需要-80℃保存,干冰运输。

水体:1-3l水样用0.22μm滤膜过滤

水样的取样深度和和范围,可根据研究目的进行确定。水样或者略浑浊的水样,取水样≥1l,低温环境下运输至实验室,0.22μm过滤后将滤膜放置冻存管中,干冰运输寄送。

粪便:3g;

取人粪便时,为了避免尿液的污染,可先排尽尿液。用无菌勺子取粪便内部(注:粪便表面与空气接触容易产生变化,不建议取表面样品)。取完后将样品存于专门的粪盒,需-80℃保存,干冰运输。

小鼠粪便需要提供1g以上。

黏膜:指甲大小(约0.8cm*0.8cm)

可使用牙签刮取、扁平刮取片刮取、刀片刮取以及漱口水沉降等方法。需要-80℃保存,干冰运输。

肠道内容物

用无菌解剖刀,在无菌状态下取出腹腔肠道并用pbs冲洗,放置-80℃保存,干冰运输。

血液:10ml

可使用无菌采血针,保存在edta漂洗微量管中。需要-80℃保存,干冰运输。

叶片表面:50-100g

用无菌水冲洗,冲洗以后收集无菌水用滤膜过滤。需要-80℃保存,干冰运输。

物体表面微生物样本

将物体置于无菌容器内,加入适量的pbs浸没物体,利用摇床等仪器旋转震荡,使表面微生物与物体脱落,收集水样,低温高速离心,收集沉淀。需要-80保存,干冰运输。

口腔样本

口腔表面样本可采用拭子形式或漱口水形式提供,唾液可直接进行收集后送样,干冰运输。

实验方案设计流程如下:

常见问题

q:哪些环境样品可以进行微生物多样性检测?

a:针对宿主的相关样品如皮肤、口腔、呼吸道、消化道、生殖道等;针对环境的相关样品,如土壤、水体、空气、盐湖、沼泽等,均可进行微生物多样性检测。

q:进行环境微生物多样性测序一般可以鉴定到物种的哪个分类水平?

a: 一般用16s rrna基因测序可以分类到属的级别,现有的rrna序列数据库提供的物种分类软件也只支持鉴定到属的级别。这主要是因为16s rrna序列在某些物种间差别非常小加上测序固有的错误率存在,我们如果降低取信要求,鉴定到种,能够使用的序列过少,鉴定的结果可靠性也会降低。

q:客户想关注某些特定的菌,比如甲烷氧化细菌、固氮菌等。进行16s rrna测序可否注释一下哪些菌属于这类菌的范畴?

a:可以。我们公司的标准分析项目包含各个样本中物种的注释。标准分析结果中客户会得到含有物种注释的文件。客户可以在此基础上挑选出感兴趣的物种。但标准分析中并不包含挑出特定物种进行丰度图的绘制以及热图等的绘制。若客户有此需求,为定制化分析(属于高级分析项目)。

q:环境微生物多样性测序的应用领域?

a:环境微生物多样性测序的应用领域非常广:包括疾病诊断、疾病机理、药效评价、药物机理等医药方面;环境微生物差异研究、生物地理学研究等环境生态学方面; 植物保护、连作障碍、作物生长与根际微生物关系等植物科学方面;动物肠道微生物研究等动物科学方面;污水处理、油污利用、酿酒微生物研究等工业应用方面;还有某些重要次生代谢物相关的环境微生物多样性研究等。

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