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项目文章 | 发文三连击!欧易客户在乳腺癌肿瘤细胞的转移调控机制取得新进

2018-09-27 11:07:18 

基本信息

论文题目:hippo component yap promotes focal adhesion and tumour aggressiveness via tranionally activating thbs1/fak signalling in breast cancer

hippo组分yap通过转录激活乳腺癌中的thbs1 / fak信号传导促进粘着斑和肿瘤侵袭性

发表期刊:journal of experimental & clinical cancer research

发表时间:2018

影响因子:6.217

作者单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院

本文涉及的高通量技术:基因表达谱芯片(由欧易生物提供服务)

研究背景

乳腺癌是女性当中导致死亡的最重要的肿瘤性疾病,其的杀伤力主要来源于乳腺肿瘤细胞的侵袭和转移。粘着斑(focal adhesion, fa)在肿瘤的转移和侵袭性中具有重要作用,其动力学主要受到粘着斑激酶(focal adhesion kinase, fak)及其磷酸化(tyr397)的作用,fak的活性和表达量的增加通常和肿瘤细胞的转移和不良预后有关。

在肿瘤生物学中,hippo信号通路是重要的调控网络,yap蛋白可以与转录因子teads结合,诱导靶向基因的转录。yap基因被认为是乳腺癌的致癌基因,其异常表达会导致肿瘤细胞的侵袭和转移,但其分子机制还需要进一步探索。

研究内容

本研究揭示了临床乳腺肿瘤样本中yap激活与肿瘤转移的潜在关系。通过体外实验发现,yap能够显著促进fa的形成以及提高fak的活性,并且yap-tead的相互作用是该生物学过程的必要条件。

通过基因表达谱芯片筛选发现,fak的刺激物血小板反应蛋白1(thrombospondin 1, thbs1)是hippo信号通路的直接转录靶标。进一步研究证明,yap/tead通过促进thbs1的表达促进fak的磷酸化以及fa的形成,从而提高肿瘤细胞的转移和侵袭。

研究思路

研究结果

1. yap的过表达和激活与乳腺癌肿瘤细胞的淋巴转移和预后不良有关免疫组织染色发现,淋巴转移肿瘤细胞中yap的表达水平比原发灶组织细胞中的yap的表达水平高。survexpress分析结果将病人分为了“low risk”和“high risk”两组,后者的 yap表现出显著的高表达,且预后不良。

图1 | 免疫组织染色显示淋巴转移瘤中 yap 的表达水平比原发病灶中的高

2. yap诱导乳腺肿瘤细胞的转移和侵袭,以及粘着斑(fa)的形成mda-mb-231和 mcf7两个细胞系分别具有较高和较低的转移潜能,在两个细胞系中分别对 yap 进行敲除和过表达。transwell assay实验显示,yap的表达水平与肿瘤细胞的转移和侵袭成正相关。免疫荧光实验发现,过表达的 yap与粘着斑的数量具有很强的相关性。

图2 |(c、d)过表达yap能够诱导mcf7细胞的转移和侵袭;(e、f)敲降yap能够显著阻碍mda-mb-231细胞的转移和侵袭

3. yap-tead相互作用在肿瘤细胞侵袭和粘着斑的形成中的必要性选择两种 pcdna3.1-yap 突变质粒(flag-tagged-yap-s127a和gfp-tagged-yap-s94a)转染进入 mcf7 细胞,和 yap-s94a 突变体相比,yap-s127a 突变体的异常表达能够明显增加细胞的粘附能力,并增强细胞的转移和侵袭能力。为进一步确认yap-tead 的结合反应,使用该反应的分子抑制剂 verteporfin,结果yap-s127a 诱导的细胞粘附力和和侵袭以及粘着斑的形成均受到了显著抑制。因此在乳腺肿瘤细胞系中, yap-tead 的结合促进乳腺肿瘤细胞的侵袭性和黏着斑的形成。

图3|(c、e、f)yap-s127a 突变体的异常表达能够明显增加细胞的粘附能力,以及细胞的转移和侵袭能力;(n、p)使用分子抑制剂 verteporfin,明显逆转了 yap-s127a 诱导的细胞粘附力和侵入能力

4. yap-tead通过诱导fak激酶的磷酸化促进粘着斑的形成yap-s127a过表达能够显著诱导 fak 的磷酸化(tyr387),应用 verteporfin抑制剂或敲降yap能够显著抑制 fak 的磷酸化。为进一步确定 fak 磷酸化在 yap诱导的 fa 形成中所起的作用,发现用fak 抑制剂defactinib 治疗后, mcf7-yap-s127a 和 mda-mb-231 细胞粘着斑的数量都减少了。因此磷酸化的 fak 促进 yap-tead 对fa形成的调节。

图4 |(a)western blot分析, yap-s127a过表达能够显著诱导 fak 的磷酸化;(b、c)应用 verteporfin抑制剂能够显著抑制 fak 磷酸化;(e 、f)用fak 抑制剂defactinib 来抑制 fak tyr397的磷酸化;(h)经 defactinib 治疗后,粘着斑(fa)的数量减少

5. yap-tead能够促进fak上游调节因子thbs1的表达基因表达谱芯片检测有30个基因发生了明显的上调。go富集分析,发现thbs1在“cell adhesion”条目中发生了显著富集。

利用荧光素酶报告实验,作者证明了thbs1受到yap的调控作用。染色质免疫共沉淀技术显示, yap的过表达导致yap和thbs1启动子之间的结合能力增加。qrt-pcr证明了yap的过表达显著提升了thbs1的表达水平,敲降内源yap,则显著降低了thbs1的表达水平。因此,thbs1是yap的靶标基因,并且其转录活性受到yap-tead复合物的影响。

图5 |(c)基因表达谱芯片检测基因表达水平的heat map图;(e)go富集分析;(g)荧光素酶报告实验发现thbs1受到yap的调控作用;(j)qrt-pcr结果显示yap的过表达提升了thbs1的表达水平;(k)敲降内源yap,降低了thbs1的表达水平

6. yap通过thbs1促进fak的磷酸化和粘着斑的形成在mcf7-yap-s127a细胞中,利用sirna敲降thbs1,逆转了fak-tyr397的磷酸化,而且阻碍了yap-s127a诱导的细胞粘附和侵袭,通过免疫荧光试验发现粘着斑的数量也发生了明显的减少。同样,敲降yap的表达也发现了相似的结果。以上结果证明,yap通过thbs1驱动fak的磷酸化和粘着斑的形成。

图6 |(a)western blot实验显示,敲降thbs1逆转了fak-tyr397的磷酸化;(d、e)qrt-pcr结果显示,敲降thbs1阻碍了细胞粘附和侵袭;(g)敲降yap逆转了fak-tyr397的磷酸化;(j、k)敲降yap阻碍了细胞粘附和侵袭

总结

在乳腺癌疾病中,yap通过调节thbs1的转录活性及其表达水平,进而调控 fak tyr397的磷酸化,诱导粘着斑的形成以及肿瘤细胞的侵袭和转移能力。

参考文献

shen j, cao b, wang y, et al. hippo component yap promotes focal

adhesion and tumour aggressiveness via tranionally activating

thbs1/fak signalling in breast cancer. journal of experimental & clinicalcancer research 2018. 37(1): 175.

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雨田 撰文

本文系欧易生物原创

转载请注明本文转自欧易生物

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