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项目文章 | 欧易客户发现ralf1信号转导中ebp1负向调控作用的分子机制

2018-10-26 17:44:19 

基本信息

论文题目:ebp1 nuclear accumulation negatively feeds back on feronia-mediated ralf1 signaling

ebp1的细胞核内积累负向作用于feronia调节的ralf1信号转导

发表期刊plos biology

发表时间:2018.10

影响因子:9.163

作者单位:湖南大学于峰教授

本文涉及的高通量技术:rna-seq(由上海欧易生物提供服务)

研究背景

feronia (fer) 是细胞膜表面受体蛋白激酶,作为 ralf1 多肽信号的受体,可通过胞外域与 ralf1 直接结合来感受 ralf1 信号刺激并将该信号传递至细胞内,驱动一系列下游反应,包括抑制细胞质膜表面的氢泵活性(arabidopsis h+-atpase 2,aha2)和调控细胞核内基因表达,来控制细胞生长,但其机制尚不清楚。

研究内容

本研究发现,通过与 ralf1 结合,fer 首先提高 erbb3 结合蛋白1基因(erbb3-binding protein 1,ebp1)的 mrna 的转录本水平,并使得 ebp1 蛋白发生磷酸化和 ebp1 的细胞核内积累。ebp1 与先前鉴定的 ralf1 调控基因(如cml38)结合,来调控这些基因的转录,响应 ralf1 信号转导,形成 ralf1-fer-ebp1 的反应轴线。研究还发现 ebp1 能够抑制 ralf1 的多肽反应,形成转录本-翻译反馈回路(transcription–translation feedback loop,ttfl)。

研究思路

研究结果

1.ralf1-fer 促进 ebp1 的 mrna 转录,导致 ebp1 蛋白水平增加

western blot 实验发现,ralf1 促进了 ebp 1蛋白的积累,且具有 fer 依赖性。通过 qpcr 发现,ebp1 mrna 的表达量(转录水平上)并未受到 ralf1 的显著影响,而是通过某种机制和转录后调控相关。接着作者又利用 polysome profiling 分析发现,ralf1 对ebp1 mrna 翻译的促进作用取决于 fer,用环己酰亚胺(cycloheximide,chx,一种mrna翻译阻碍因子)阻碍蛋白的合成,发现 ebp1 不再积累。以上实验说明,ralf1 能够通过改变 ebp1 mrna 的翻译,影响ebp1蛋白的积累。

图 |(a)经 ralf1 处理后的 col-0 和 fer-4 两个植物实验组ebp1积累的时间过程,actin 为对照组;(b-f)polysome profiling 和 qrt-pc r分析ebp1 和 eif4a1 mrna 的翻译状态;(h)ralf1 (1 μm for 2 hours) 使 ebp1 mrna 的翻译,chx 作用后 ebp1 不再积累,actin 为对照组

2.ebp1在核内积累和发生磷酸化

利用免疫印迹分析和免疫荧光检验分析,证明了 ebp1 在细胞核内积累。构建了一个脱落酸(aba)诱导的体外磷酸化系统,分析得出ebp1是fer的磷酸化底物,受到 fer 激酶的作用而发生磷酸化,并进一步确定了 ebp1 的 10 个磷酸化位点。

图 | (a)ebp1 体外磷酸化分析。结果显示了磷酸化和去磷酸化的 fer-kd-s 和 ebp1-his;(b)ebp1 磷酸化分析,检测得到 fer 的磷酸化水平,pser 和 pthr 抗体用于发现磷酸化 ebp1

3.ebp1对ralf1多肽信号传导产生负向调控作用

基于fer-4,ebp1,ebp1-gfp和ebp1-oe等基因的突变型和野生型,作者进行了多个 ralf1 多肽反应分析,观察对 ralf1 的敏感性,并通过 qrt-pcr 检测 fer 的相对表达水平。结果说明,ebp1 对 ralf1-fer 信号通路发挥下调作用,对 ralf1 应答产生负向调控作用。

图 |ebp1 抑制 ralf1 多肽应答。不同字母的值之间有显著差异(p < 0.05),采用的检测方法是 anova

4.ebp1 与基因的启动子结合来调控基因表达

作者选取 col-0 (经 ralf1 处理和未处理)、ebp1-1 和 fer-4 四个组,通过rna 测序,检测 ebp1 调控基因的表达水平,并用 david 对差异表达基因进行功能注释,发现了与信号转导、转录事件和应激性反应等有关的共有基因,ebp1通过调控这里面的基因作用于 ralf1-fe r信号转导通路。利用 chip 实验和 qpcr 分析,得到了 ralf1 处理促进 ebp 1结合的四个基因(cml38、ckx4、erf1b和saur9)。对cml38进一步分析,利用电泳迁移率变动分析,证实了 ebp1 蛋白和cml38结合的 motif 区域。通过双荧光素酶测定,证明了在 ralf1 信号转导中 ebp1 抑制了cml38的 mrna 的表达水平,从而调控cml38的表达。

图 |ralf1-fer-ebp1 信号通路调控基因的表达。(a、b)venn 图展示了 ebp1-1 和 fer-4 突变体上调和下调的差异表达基因数;(c)venn 图展示了 ebp1-,fer-和 ralf1 调控基因的总数和共有基因数;(d)chip 实验得到了和 ebp1 结合的cml38的启动子;(e)竞争性 emsa 展示了与 ebp1 结合的 “ccacgtc”motif 区域;(f)dual-luc 实验证明了 ebp1 抑制了cml38的 mrna 的表达量

总结

ralf1-fer 信号转导提高了 ebp1 蛋白的表达水平,ebp1 在细胞核内积累和磷酸化。ebp1 和 ralf1-fer 调控基因的启动子区域结合,抑制基因的表达,在 ralf1-fer 信号转导中发挥负向调控作用。

参考文献

li c, liu x, qiang x, li x, li x, zhu s,et al.(2018) ebp1 nuclear accumulation negatively feeds back on feronia-mediated ralf1 signaling.plos biol16(10): e2006340. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006340.

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本文系欧易生物原创

转载请注明本文转自欧易生物

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